Οι ενώσεις συναρμογής του Ru ελκύουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον ως εναλλακτικά αντικαρκινικά μεταλλοφάρμακα καθώς εμφανίζουν χαμηλότερη τοξικότητα και υψηλότερη εκλεκτικότητα έναντι συγκεκριμένων καρκινικών σειρών σε σχέση με τις ευρέως χρησιμοποιούμενες ενώσεις συναρμογής του Pt. Προηγούμενες μελέτες, εστιασμένες στη σύνθεση και βιολογική αξιολόγηση μεταλλοφαρμάκων Ru, έχουν αποδώσει τις ευνοϊκές ιδιότητες τους και το φαρμακολογικό τους προφίλ κυρίως στις αλληλεπιδράσεις τους με πρωτεΐνες καθώς το DNA δεν αποτελεί τον βασικό στόχο τους. Ως εκ τούτου, η διερεύνηση ερωτημάτων σχετικά με τον τρόπο πρόσδεσης, τις
αλληλεπιδράσεις και την εκλεκτικότητα τους σε πρωτεϊνικές περιοχές
πρόσδεσης αποτελούν κλειδιά για τη κατανόηση της δράσης τους ανοίγοντας νέους δρόμους στον σχεδιασμό ενώσεων συναρμογής του Ru με βέλτιστες φαρμακολογικές ιδιότητες.
Στην παρούσα διατριβή τα ερωτήματα αυτά διερευνήθηκαν με δομική
μελέτη, μέσω κρυσταλλογραφίας ακτίνων-Χ, συμπλόκων μεταξύ ενώσεων συναρμογής Ru(II)/Ru(III) και πρωτεϊνικών στόχων. Χρησιμοποιήθηκαν οι ακόλουθες ενώσεις συναρμογής: Η Ένωση Συναρμογής-1 (ΕΣ-1) [RuII(1,4,7-trithiacyclononane) (ethane-1,2-diamine)Cl] + , η οποία αποτελεί ένωση συναρμογής τύπου «half-sandwich» του Ru(II) και η Ένωση Συναρμογής-2
(ΕΣ-2) [ImidazoleH]trans-[RuCl 4 (dmso-S)(imidazole)], η ευρέως γνωστή ως ΝΑΜΙ-Α ένωση συναρμογής του Ru(III), πολλά υποσχόμενο μεταλλοφάρμακο του Ru που έχει περάσει ήδη στις Φάσεις Ι/ΙΙ κλινικών δοκιμών.
Ως πρωτεϊνικοί στόχοι για την ΕΣ-1 επιλέχθηκαν δύο ένζυμα: η Λυσοζύμη (hen egg-white lysozyme, HEWL), η οποία αποτελεί σύνηθες μοντέλο για τη διερεύνηση της πρόσδεσης μεταλλοφαρμάκων σε αυτήν, και η πρωτεϊνάση Κ (PK), η οποία χρησιμοποιήθηκε για πρώτη φορά ως μοντέλο πρωτεΐνης σε μελέτες μετάλλωσης, αναδεικνύοντας έναν πολύ καλό οδηγό για παρόμοιες έρευνες. Για την ΕΣ-2, η μελέτη έγινε με στόχο αποκλειστικά τη λυσοζύμη. Ο προσδιορισμός των κρυσταλλικών δομών επετεύχθη σε υψηλή (ατομική) διακριτότητα και από την ανάλυσή τους προέκυψαν τα ακόλουθα αποτελέσματα και συμπεράσματα.
Η ΕΣ-1 (RuTE) συναρμόζεται μέσω ενός ομοιοπολικού δεσμού με τα
εκτεθειμένα στο διαλύτη αμινοξικά κατάλοιπα ασπαρτικού οξέος των
ενζύμων-στόχων (Asp101 στην HEWL, Asp200 και Asp260 στην PΚ), έπειτα από απελευθέρωση του χλωρίου υποκαταστάτη ενώ παραμένουν οι δύο χηλικοί υποκαταστάτες της ένωσης. Οι κρυσταλλογραφικά προσδιορισμένες δομές παρουσιάζουν για πρώτη φορά την πρόσδεση σε πρωτεΐνη μίας ένωσης τύπου «half sandwich» του Ru(II) με τη σφαίρα συναρμογής της σχεδόν ακέραια. Από τη δομική ανάλυση προκύπτουν σημαντικά συμπεράσματα για τις περιοχές και τον τρόπο πρόσδεσης του RuTE σε συγκεκριμένα αμινοξικά κατάλοιπα των πρωτεϊνών και για τον ρόλο των υποκαταστατών του Ru(II) τόσο στην εκλεκτικότητα του RuTE σε σχέση με το ηλεκτροστατικό δυναμικό των ενζύμων-στόχων όσο και στην σταθεροποίηση των συμπλόκων μέσω δεσμών υδρογόνου, υδροφοβικών και αρωματικών
αλληλεπιδράσεων.
Η ΕΣ-2 (ΝΑΜΙ-Α) μελετήθηκε στο σύμπλοκό της με λυσοζύμη, μέσω της
ανάλυσης 4 δομών που προσδιορίστηκαν από κρυστάλλους λυσοζύμης
εμβαπτισμένους σε ΝΑΜΙ-Α για διαφορετικά χρονικά διαστήματα και
συγκεκριμένα για 1.5, 8.0, 26 και 98 ώρες αντίδρασης. Οι 3 πρώτες δομές αποκαλύπτουν για πρώτη φορά την αρχική, μη ομοιοπολική, αλληλεπίδραση ακέραιου ΝΑΜΙ-Α με τη λυσοζύμη, ακολουθούμενη από μία σταδιακή ανταλλαγή όλων των υποκαταστατών του Ru εκτός του ιμιδαζολίου μέχρι τις 26 ώρες. Στα σύμπλοκα αυτά, εμφανίζονται 3 θέσεις πρόσδεσης του ΝΑΜΙ-Α στη HEWL, με το ιμιδαζόλιο να καθορίζει τη σταθεροποίηση τους. Στην τελική ένωση προσθήκης του Ru στις 98 ώρες, ένα ιόν Ru βρίσκεται συναρμοσμένο στην ιστιδίνη-15 της λυσοζύμης. Η δομή του συμπλόκου στις 98 ώρες βρίσκεται σε συμφωνία με προηγούμενες όμοιες κρυσταλλογραφικές μελέτες.
Τα αποτελέσματα αυτά υποστηρίζουν έναν μηχανισμό δύο βημάτων στην πρωτεϊνική ρουθηνίωση και φανερώνουν τον ρόλο των υποκαταστατών στο βήμα της αναγνώρισης κατά τη διαδικασία αυτή.
The Ru coordination compounds attract particular interest as alternative
anticancer metallodrugs due to their lower toxicity and higher specificity
against specific cancer lines compared to the widely used coordination
compounds of Pt. Their pharmacological profile has been ascribed to their interactions with proteins, as several previous studies have provided evidence that DNA is not the primary target. In this regard, the investigation of their binding with target proteins, by a detailed structural analysis of the binding mode geometrical features and interactions which reveal the specificity for the protein binding sites, is crucial for the understanding of their action and the design of novel coordination compounds of Ru with optimal pharmacological properties.
In the present thesis, high-resolution X-ray crystal structures of complexes of Ru(II) and Ru(III) coordination compounds with protein targets are presented and extensively analyzed. The examined compounds were the “half sandwich”-type Ru(II) coordination compound [Ru II (1,4,7-trithiacyclononane)(ethane-1,2-diamine)Cl] + (RuTE) and the antimetastatic metallodrug imidazolium trans-[tetrachloride(S-dimethyl sufoxide) (1H-imidazole) ruthenate(III)] (NAMI-A, a widely known promising metallodrug of Ru(III) already in Phase I/II clinical trials). The protein targets were two enzymes: the Hen Egg White Lysozyme (HEWL) and the Proteinase K (PK).
HEWL is an ordinary model system of protein metalation studies and it was used as a target for both RuTE and NAMI-A, whereas PK was used here for the first time as such, forming a complex with RuTE.
The determination of high (atomic) resolution crystal structures by X-ray
crystallography and their analysis revealed the following:
RuTE is coordinated by a covalent bond to the solvent exposed residues of Aspartic acid of the enzyme-targets (Asp101 in HEWL, Asp200 and Asp260 in PK), followed by a release of a chloride ligand while retaining the two chelating ligands of the compound. The crystal structures show for the first time the binding of a “half-sandwich” type compound of Ru(II) to a protein, that maintains its coordination sphere almost intact. From the structural analysis, several significant conclusions were derived considering the binding mode of RuTE with protein residues in specific binding sites and the stabilization of the complexes via hydrogen bonds, hydrophobic and aromatic
interactions.
The complex formed between NAMI-A and HEWL was studied by analyzing a series of near atomic-resolution X-ray crystal structures determined by crystals obtained at four time points of soaking HEWL crystals with excess NAMI-A (1.5, 8.0, 26 and 98 h). These structures elucidate a series of binding events starting from the noncovalent interaction of intact NAMI-A ions with HEWL (1.5 h), followed by the stepwise exchange of all Ru ligands except for 1H-imidazole (26 h) to the final “ruthenated” protein comprising one aquated Ru ion coordinated to histidine-15 of HEWL (98 h). The structural data clearly
support a two-step mechanism of protein ruthenation, illustrating the ligand-mediated recognition step of the process.
