Ενδοφυτικοί μικροοργανισμοί των αρωματικών φυτών Teucrium polium και Hypericum hircinum που προάγουν την ανάπτυξη των φυτών

Abstract

Η αύξηση του πληθυσμού της γης και η επακόλουθη αύξηση στη ζήτηση τροφίμων, σε συνδυασμό με την απώλεια γεωργικών εδαφών και τη μείωση απόδοσης της παραγωγής λόγω της κλιματικής αλλαγής, έχουν οδηγήσει στην εκτεταμένη χρήση χημικών λιπασμάτων και φυτοπροστατευτικών προϊόντων. Οι δυσμενείς επιδράσεις της υπερχρήσης αγροχημικών στην υγεία του ανθρώπου και του περιβάλλοντος δημιούργησαν την ανάγκη για την ανάπτυξη μεθόδων για την αύξηση της απόδοσης και τη μείωση των απωλειών των καλλιεργειών, με ταυτόχρονη μείωση των χημικών εισροών. Μία πολλά υποσχόμενη λύση για την αύξηση της απόδοσης και τη μείωση των απωλειών είναι η χρήση περιβαλλοντικά φιλικών και ταυτόχρονα αποτελεσματικών μεθόδων, όπως είναι η εφαρμογή μικροοργανισμών που προωθούν την ανάπτυξη των φυτών, με τα ενδοφυτικά βακτηριακά στελέχη να προσελκύουν όλο και περισσότερο ενδιαφέρον. Η συγκεκριμένη εργασία αφορά τη διερεύνηση των ικανοτήτων των ενδοφυτικών βακτηρίων που απομονώθηκαν από τη ρίζα και τα φύλλα των αρωματικών φυτών Teucrium polium και Hypericum hircinum με σκοπό την εύρεση στελεχών υποσχόμενων για χρήση ως εμβόλια στη γεωργική πρακτική, καθώς και τη διερεύνηση της αύξησης της αποτελεσματικότητάς τους ως μίγματα ανά ζεύγη. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης πραγματοποιήθηκε η ομαδοποίηση 37 βακτηριακών απομονώσεων βάσει της μορφολογίας των μοναδιαίων αποικιών τους και την προκαταρκτική 16S rDNA φυλογενετική ταξινόμηση. Η επιλογή αντιπροσωπευτικών στελεχών με πιθανή διαφορετική δράση βασίστηκε σε in vitro δοκιμές α) προώθησης της ανάπτυξης των φυτών, όπως η διαλυτοποίηση ιζηματοποιημένου φωσφόρου, η παραγωγή ρυθμιστών της ανάπτυξης των φυτών και η έκκριση λυτικών ενζύμων, β) περιβαλλοντικής προσαρμογής, όπως η αντοχή σε ακραίες θερμοκρασίες, γ) διερεύνησης πιθανής παθογόνου δράσης σε φυτά Arabidopsis thaliana Col-0 και δ) αλληλεπίδρασης των βακτηριακών στελεχών μεταξύ τους. Από αυτά επιλέχθηκαν 19 αντιπροσωπευτικά στελέχη, τα οποία υποβλήθηκαν στη συνέχεια σε in vitro δοκιμές που αφορούσαν την ικανότητα ταχείας ομαδικής κίνησης σε επιφάνειες (swarming), κολυμβητικής κίνησης (swimming), σχηματισμού βιοϋμενίου (biofilm), καθώς και παρεμπόδισης φυτοπαθογόνων μυκήτων σημαντικών για τη γεωργία. Ακόμη, εξετάστηκε η επίδρασή τους στην ανάπτυξη του φυτού A. thaliana Col-0 in vitro, μετά τον εμβολιασμό τους σε επαφή με το ακρορρίζιο, σε απόσταση από αυτό και μέσω πτητικών ενώσεων. Κριτήριο επιλογής αποτέλεσε η αύξηση των πλευρικών ριζών και ριζικών τριχιδίων. Ακολούθησε η εξέταση της επίδρασής τους στη βλαστικότητα και την ανάπτυξη φυτών τομάτας in vitro μετά από βιοδιέγερση (biopriming) του σπόρου. Ο συνδυασμός των αποτελεσμάτων των in vitro δοκιμών οδήγησε στην επιλογή των στελεχών Hil4 (Bacillus halotolerans), Hir139 (Bacillus velezensis), Tel34 (Bacillus safensis), Tel52 (Bacillus velezensis) και Ter90 (Bacillus subtilis), τα οποία συγκέντρωσαν τα περισσότερα επιθυμητά χαρακτηριστικά. Διαπιστώθηκε ότι τα στελέχη Hil4, Hir139, Tel52 και Ter90 εκκρίνουν βιοεπιφανειοδραστικές ενώσεις με αντιμυκητολογική δράση σε υγρή καλλιέργεια, ενώ σχηματίστηκε ζώνη παρεμπόδισης εναντίον φυτοπαθογόνων μυκήτων κατά τη διπλή καλλιέργεια τους in vitro. Για την μελέτη και ανίχνευση των εκκρινόμενων και διαχεόμενων μεταβολιτών, πραγματοποιήθηκε η εκχύλισή τους από τη ζώνη παρεμπόδισης που δημιουργήθηκε εναντίον του μύκητα Botrytis cinerea σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα και από ζώνη παρόμοιου μεγέθους αξενικής βακτηριακής καλλιέργειας. Τα εκχυλίσματα των Hil4, Hir139, Tel52, Ter90 ήταν βιοδραστικά έναντι του B. cinerea σε διπλή καλλιέργεια και διαπιστώθηκε πως οι αντιμυκητιακοί μεταβολίτες παράγονται ιδιοσυστατικά. Μετά από αλληλούχιση ολικού γονιδιώματος, τα στελέχη ταυτοποιήθηκαν σε επίπεδο είδους και διερευνήθηκε η παρουσία συστάδων γονιδίων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση αντιμικροβιακών δευτερογενών μεταβολιτών, που ανταγωνίζονται άμεσα τα φυτοπαθογόνα ή λειτουργούν ως διεγέρτες της άμυνας των φυτών. Σε όλα τα στελέχη βρέθηκε η συστάδα βιοσύνθεσης ενώσεων της οικογένειας των κυκλικών λιποπεπτιδίων Surfactins, της σιδηροφόρου ένωσης Bacillibactin και της ένωσης Bacilysin. Στα γονιδιώματα των στελεχών Hil4, Hir139, Tel52 και Ter90 εντοπίστηκε η συστάδα βιοσυνθετικών γονιδίων της ένωσης Bacillaene, καθώς και η συστάδα βιοσύνθεσης ενώσεων της οικογένειας των κυκλικών λιποπεπτιδίων Fengycins. Στα γονιδιώματα των στελεχών Hil4 και Ter90 εντοπίστηκε η συστάδα βιοσύνθεσης της Subtilosin, ενώ οι συστάδες βιοσυνθετικών γονιδίων των ενώσεων Difficidin, Macrolactin H και Amylocyclicin εντοπίστηκαν μόνο στα γονιδιώματα των στελεχών Hir139 και Tel52. Η συστάδα βιοσύνθεσης της ένωσης Plantazolicin εντοπίστηκε στο γονιδίωμα του στελέχους Hir139, ενώ της ένωσης Mersacidin εντοπίστηκε στο γονιδίωμα του στελέχους Tel52. Το γονιδίωμα του στελέχους Tel34 περιέχει τη συστάδα βιοσύνθεσης της ένωσης Safencin. Τέλος, εντοπίστηκε συστάδα για τη βιοσύνθεση κυκλικών λιποπεπτιδίων της οικογένειας Iturins στα στελέχη Hil4 (Mojavensin), Hir139 και Tel52 (Bacillomycin D). Επίσης, στα γονιδιώματα των στελεχών διαπιστώθηκε η παρουσία πληθώρας γονιδίων που εμπλέκονται στον αποικισμό, την προώθηση της ανάπτυξης των φυτών και τη βιολογική αντιμετώπιση φυτοπαθογόνων μικροοργανισμών, όπως εκείνα που κωδικοποιούν λυτικά ένζυμα. Ανάλυση UHPLC-HRMS του εκχυλίσματος των εκκρινόμενων και διαχεόμενων μεταβολιτών κατά την αξενική καλλιέργεια σε στερεό υπόστρωμα των Hil4 και Hir139 έδειξε την πιθανή παρουσία των ενώσεων Surfactin Α (C13-C15), Fengycin A (C16), Bacillaene, Bacilysin, Dihydroanticapsin (ενεργό μέρος της Bacilysin) αλλά και Azelaic Acid. Ακόμη, ανιχνεύθηκε η ένωση Bacillomycin D (C13-C17) και Oxydifficidin ως εκκρινόμενη από το στέλεχος Hir139, ενώ ανιχνεύθηκε η ένωση Mojavensin ως εκκρινόμενη από το στέλεχος Hil4. Τα επιλεγμένα στελέχη χρησιμοποιήθηκαν για τη δημιουργία μιγμάτων (ανά ζεύγη) μετά από δοκιμές in vitro συμβατότητας, συνδυάζοντας στελέχη με διαφορετικά χαρακτηριστικά και πρεριλαμβάνοντας in vitro συμβατά και μη συμβατά μίγματα. Συγκεκριμένα, τα μίγματα που δοκιμάστηκαν ήταν τα Hil4-Tel52, Tel34-Ter90 και Tel34-Hir139. Στη δοκιμή προώθησης της ανάπτυξης φυτών τομάτας σε συνθήκες θερμοκηπίου, το στέλεχος Ter90 είχε τη μεγαλύτερη επίδραση στο νωπό βάρος υπόγειου τμήματος, το ύψος, καθώς και το νωπό και ξηρό βάρος του υπέργειου τμήματος σε σύγκριση με όλες τις μεταχειρίσεις και το μάρτυρα. Τα υπόλοιπα στελέχη έδειξαν να προωθούν την ανάπτυξη των φυτών μόνο σε συνθήκες in vitro και όχι στο θερμοκήπιο. Η μεταχείριση του μίγματος Hil4-Tel52 εμφάνισε σε κάποια χαρακτηριστικά υψηλότερες τιμές από εκείνες των μεμονωμένων, γεγονός που ίσως οφείλεται στην αύξηση του πληθυσμού τους στη ριζόσφαιρα, αλλά σε σύγκριση με του μάρτυρα υπερίσχυε μόνο στο ύψος και το ξηρό βάρος υπέργειου τμήματος του φυτού. Δοκιμή των στελεχών σε αποκομμένους καρπούς ελιάς εναντίον του φυτοπαθογόνου μύκητα Colletotrichum acutatum, έδειξε ότι οι μεταχειρίσεις Ter90 και Hir139 παρουσίασαν περίπου 45% και 57% μείωση του δείκτη σοβαρότητας της ασθένειας σε σχέση με τη μεταχείριση του μάρτυρα, αντίστοιχα, ενώ 33% και 60% μείωση της έντασης της ασθένειας, αντίστοιχα. Επίσης, η εφαρμογή όλων των στελεχών μείωσε τη σοβαρότητα της τεφράς σήψης σε καρπούς αμπέλου και μικρόκαρπες τομάτες, με πιο αποτελεσματικό το στέλεχος Hir139, το οποίο μείωσε τη σοβαρότητα της ασθένειας περίπου 52.5% και 47% στους δύο καρπούς αντίστοιχα. Το μίγμα Hil4-Tel52 μείωσε σημαντικά τη σοβαρότητα της ασθένειας στα τοματίνια σε σύγκριση με τα μεμονωμένα στελέχη, ωστόσο δεν είχε διαφορά από το Hir139. Στη δοκιμή αντιμετώπισης του B. cinerea στα φύλλα μέσω επαγωγής της διασυστηματικής αντοχής φυτών τομάτας μετά από εμβολιασμό των στελεχών στη ριζόδφαιρα, το στέλεχος Hir139 αναδείχθηκε το αποτελεσματικότερο με περίπου 75% μείωση της έκτασης νεκρωτικής κηλίδας, ακολουθούμενο από τα Ter90 και Tel52 με περίπου 71% και 67% μείωση, αντίστοιχα. Επίσης, κάποιες από τις μεταχειρίσεις έδειξαν αυξημένα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων erf1 και aco1 24 ώρες μετά το πρώτο ριζοπότισμα με βακτήρια σε σύγκριση με τη μεταχείριση του μάρτυρα. Τα αποτελέσματα της μελέτης αυτής ανέδειξαν δύο υποσχόμενα στελέχη, τα Hir139 και Ter90, με εξαιρετικά αποτελέσματα στην προώθηση της ανάπτυξης των φυτών και τη βιολογική αντιμετώπιση φυτοπαθογόνων μυκήτων. Όσον αφορά τα μίγματα που εξετάστηκαν, στις περισσότερες περιπτώσεις είχαν είτε αντίστοιχη δράση με το αποτελεσματικότερο στέλεχος του μίγματος, είτε μειωμένη δράση στην περίπτωση που ο πληθυσμός του υπέστη μείωση όταν εφαρμόστηκε σε μίγμα σε σχέση με την εφαρμογή ως μεμονωμένο στέλεχος, πιθανώς λόγω ανταγωνισμού. Ακόμη, οι in vitro δοκιμές συμβατότητας δεν αντικατόπτριζαν πάντα τη συμβατότητα in planta σε όλα τα συστήματα. Συμπερασματικά, η εργασία αυτή αποτελεί μια ενδελεχή μελέτη της αποτελεσματικότητας ενδοφυτικών βακτηριακών στελεχών ως βιοδιεγέρτες της ανάπτυξης των φυτών και ως παράγοντες βιολογικής αντιμετώπισης φυτοπαθογόνων μυκήτων, καθώς και έναν οδηγό για την αξιολόγηση υποσχόμενων βακτηριακών στελεχών. Επιπρόσθετα, εμβαθύνει στην κατανόηση της αλληλεπίδρασης των βακτηριακών στελεχών μεταξύ τους με σκοπό τη δημιουργία αποτελεσματικών μιγμάτων.

The world population rise and the subsequent increase in food demand combined with agricultural land loss and decrease of crop production due to climate change have led to the extended use of chemical fertilizers and plant protection products. The adverse effects of agrochemical overuse on environmental and human health have created the need for development of methods to achieve increase of crop yield and decrease of losses with simultaneous minimization of chemical inputs. Α very promising solution is the use of plant growth promoting bacteria, including culturable endophytes which attract increasing interest over the last years. This study concerns the screening of endophytic bacteria isolated from the root and leaves of aromatic plants Teucrium polium και Hypericum hircinum with the aim of finding promising strains for use in agricultural practice, as well as investigating the possible efficacy enhancement when applied as pairs. During the first stage, 37 endophytic bacterial isolates were grouped based on colony morphology and a preliminary 16S rDNA phylogenetic analysis. The selection of representative isolates was carried out by in vitro assays regarding: a) plant growth promotion traits, such as phosphate solubilization, production of plant growth regulators and lytic enzyme secretion, b) environmental fitting, such as resistance in extreme temperature, c) potential pathogenic effect on Arabidopsis thaliana Col-0 and d) interaction among the bacterial strains. The selected 19 representative strains were further subjected to in vitro tests concerning the ability of fast swarming motility, swimming motility, biofilm formation, as well as inhibition of agricultural importance phytopathogenic fungi during dual culture. Also, their effect on growth and development of A. thaliana Col-0 was examined in vitro through inoculation on the root tip or at distance from the root tip as well as through volatile emission. The determinant selection factor was the increase of lateral roots and root hairs. Bacterial strains were further examined regarding their effect on the germination and growth of Solanum lycopersicum var. Chondrokatsari Messinias in vitro after seed biopriming. The combination of in vitro results led to the selection of strains Hil4 (Bacillus halotolerans), Hir139 (Bacillus velezensis), Tel34 (Bacillus safensis), Tel52 (Bacillus velezensis) and Ter90 (Bacillus subtilis), as the ones that gathered most of the desirable traits. Strains Hil4, Hir139, Tel52 and Ter90 seemed to secrete biosurfactants with antifungal activity in the liquid culture medium, while an inhibition zone was formed during their dual culture with phytopathogenic fungi on solid growth medium. In order to study and detect the secreted and diffusible secondary metabolites during solid culture, their extraction was performed from the growth medium residing at the inhibition zone against Botrytis cinerea and from a zone of equal size during single bacterial culture. Extracts of Hil4, Hir139, Tel52, Ter90 were bioactive against B. cinerea on dual culture, while the production of metabolites seemed to be constitutive. After whole genome sequencing, the selected strains were identified in species level and a search for gene clusters involved in secondary metabolite production with direct antifungal or plant defence elicitor action was carried out. The biosynthetic gene clusters (BGCs) of siderophore Bacillibactin, Bacilysin and cyclic lipopeptide family Surfactin were found in the genomes of all strains. The genome of strains Hil4, Hir139, Tel52 και Ter90 harbored the BGCs of Bacillaene and the cyclic lipopeptide family Fengycins. The BGC of Subtilosin was predicted only in the genomes of Hil4 and Ter90, while BGCs of Difficidin, Macrolactin H and Amylocyclicin were only found in the genomes of Hir139 and Tel52. Plantazolicin BGC was only found in the genome of Hir139, while Mersacidin BGC was only found in the genome of Tel52. Strain Tel34 harbored the BGC of Safencin. The presence of iturinic lipopeptides was predicted in the genomes of Hil4 (Mojavensin), Hir139 and Tel52 (Bacillomycin D). Furthermore, the genomes of all selected strains harbored genes involved in colonization, plant growth promotion and biological control were found, such as those that encode lytic enzymes. Finally, UHPLC-HRMS analysis of the extract containing secreted and agar diffusible metabolites of single Hil4 and Hir139 bacterial culture led to the putative annotation of Surfactin A (C13-C15), Fengycin A (C16), Bacillaene, Bacilysin, Dihydroanticapsin (active part of Bacilysin), as well as Azelaic Acid. Additionally, Bacillomycin D (C13-C17) and Oxydifficidin were putatively annotated as secreted by Hir139, while Mojavensin was putatively annotated as secreted by Hil4. The selected strains were paired for the development of mixtures after assays regarding their in vitro compatibility, by combining strains with different abilities and including in vitro compatible and incompatible pairs. Specifically, the mixtures tested were Hil4-Tel52, Tel34-Ter90 and Tel34-Hir139. As far as the assay of tomato growth promotion under greenhouse conditions is concerned, strain Ter90 had the biggest impact on root fresh weight, plant height as well as fresh and dry weight of shoot compared to all treatments and the control. The rest of the strains seemed to promote plant growth in vitro but not in the greenhouse. The Hil4-Tel52 treatment showed better performance in some plant characteristics than the individual strains, which may be linked to the increase of their rhizosphere population when applied as a mixture, however it only showed increase in height and shoot dry weight compared to the control. Testing of individual strains on detached olives against the phytopathogenic fungus Colletotrichum acutatum highlighted the treatments Hir139 and Ter90, which presented approximately 57% and 45% reduction in disease severity, respectively, compared to the control, while 60% and 33% reduction of disease incidence, respectively. Also, all strains managed to reduce severity of gray mold on grape fruit and cherry tomatoes, where strain Hir139 was the most effective, achieving reduction of approximately 52.5% and 47%, respectively. Mixture Hil4-Tel52 reduced severity with statistically significant difference from individual strains in cherry tomatoes, but not from Hir139. In the assay of biological control against B. cinerea in leaves through induction of tomato systemic resistance after bacterial root inoculation, strain Hir139 was the most effective achieving approximately 75% reduction in size of leaf necrotic lessions, followed by Ter90 and Tel52 achieving 71% and 67% of reduction, respectively. Also, some of the treatments showed increased expression levels of erf1 and aco1 at 24 hours post bacterial root inoculation compared to the control. In this study, two promising bacterial strains were showcased regarding their plant growth promoting and biological control abilities, Hir139 and Ter90. As far as the mixtures tested were concerned, in most cases they showed either the same efficacy as the most effective individual strain, or reduced efficacy, when the population of the most effective strain was reduced when applied in a mixture possibly due to antagonism. Also, in vitro compatibility did not always reflect in planta compatibility in all systems. In conclusion, this is a thorough study of the efficacy of endophytic bacterial strains as plant growth promoters and biological control agents, while it also constitutes a guide for the evaluation of promising bacterial strains. In addition, this study is an important step towards understanding bacterial interaction with the purpose of developing successful mixtures.