Μελέτη εγκλεισμού συστατικών τροφίμων σε κυκλοδεξτρίνες

Abstract

Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής διατριβής είναι η συλλογή και επεξεργασία όλων εκείνων των χαρακτηριστικών που αφορούν τον εγκλεισμό συστατικών τροφίμων σε κυκλοδεξτρίνες.

Οι κυκλοδεξτρίνες (CDs) είναι κυκλικοί ολιγοσακχαρίτες που αποτελούνται από μονάδες d-γλυκοπυρανόζης συνδεδεμένες μεταξύ τους με α-(1→4) γλυκοζιτικούς δεσμούς σε έναν κυκλικό σχηματισμό. Έτσι, τα μόρια της κυκλοδεξτρίνης αποκτούν τελικά ένα σχήμα κόλουρου κώνου με την μεν εξωτερική περιφέρεια να χαρακτηρίζεται ως υδρόφιλη και την δε εσωτερική κοιλότητα υδρόφοβη. Αυτή η χαρακτηριστική διττή ιδιότητα των κυκλοδεξτρινών τις καθιστά ιδανικά μόρια για τον εγκλεισμό, εντός της υδρόφοβης κοιλότητάς τους, υδρόφοβων μορίων κατάλληλου σχήματος και μεγέθους, προς σχηματισμό υδατοδιαλυτών προϊόντων εγκλεισμού. Σε αυτές τις περιπτώσεις, το μόριο της κυκλοδεξτρίνης χαρακτηρίζεται ως «ξενιστής» (host) ενώ το εγκλεισμένο μόριο ως «ξενιζόμενο» (guest).

Η πιο κοινή κυκλοδεξτρίνη που χρησιμοποιείται ευρέως σε πολλές βιομηχανίες (τρόφιμα, φάρμακα, καλλυντικά κ.α.) είναι η φυσική β-κυκλοδεξτρίνη (β-CD) που αποτελείται από επτά μονάδες γλυκόπυρανόζης, καθώς και οι παράγωγες DM-β-CD [επτάκις(2,6-δι-O-μεθυλ)-β-κυκλοδεξτρίνη] και TM-β-CD [επτάκις (2,3,6-τρι-O-μεθυλ)-β-κυκλοδεξτρίνη) που προκύπτουν με τη μεθυλίωση των πρωτοταγών και δευτεροταγών υδροξυλίων της φυσικής β-CD.

Στην παρούσα διατριβή, μελετώνται με κρυσταλλογραφία ακτίνων-Χ τα παρακάτω προϊόντα εγκλεισμού: Χοληστερόλη/β-CD, Ναριγγενίνη/DM-β-CD, Ναριγγενίνη/TM-β-CD, Καψαϊκίνη/β-CD, Καψαϊκίνη/DM-β-CD, Πιπερίνη/β-CD, Πιπερίνη/DM-β-CD, Πιπερίνη/TM-β-CD, Αραχιδονικό/TM-β-CD, Ελαϊκό/β-CD, Λινελαϊκό/β-CD, Μυρκένιο/β-CD και Τυροσόλη/DM-β-CD. Τα τελευταία χρόνια τα παραπάνω εγκλειόμενα μόρια παρουσιάζουν ιδιαίτερο ενδιαφέρον στη βιομηχανία τροφίμων, καθώς οι ιδιότητές τους επηρεάζουν την ποιότητα των τροφίμων, τη διατροφή και την υγεία του ανθρώπου. Αντιπροσωπεύουν ένα ευρύ φάσμα κατηγοριών χημικών ενώσεων, όπως στεροειδή (χοληστερόλη), φλαβονοειδή (ναριγγενίνη), αλκαλοειδή (καψαϊκίνη και πιπερίνη), λιπαρά οξέα (αραχιδονικό, ελαϊκό και λινελαϊκό οξύ), μονοτερπένια (μυρκένιο) και φαινόλες (τυροσόλη).

Το πρώτο στάδιο του πειραματικού μέρους αφορά στην κρυσταλλογραφική μελέτη των παραπάνω συμπλόκων. Στα στάδια της συγκεκριμένης μελέτης συμπεριλαμβάνονται η κρυστάλλωση των προϊόντων εγκλεισμού, η συλλογή δεδομένων περίθλασης στο περιθλασίμετρο του εργαστηρίου Φυσικής του ΓΠΑ (λ = 1,54 Å) σε κρυογονικές συνθήκες, η επεξεργασία των δεδομένων, η επίλυση και η βελτιστοποίηση των τελικών τρισδιάστατων δομών. Η παραπάνω μελέτη παρείχε σημαντικές πληροφορίες για τη στοιχειομετρία των συμπλόκων στην κρυσταλλική κατάσταση, τη συμμετρία των κρυστάλλων, τον τρόπο εγκλεισμού, τις διαμοριακές αλληλεπιδράσεις κ.α. Οι συνολικά δεκατρείς κρυσταλλικές δομές καθορίστηκαν και καταχωρήθηκαν στη βάση δεδομένων Cambridge Structural Database (CSD).

Κατόπιν, με βάση τις τελικές κρυσταλλικές δομές πραγματοποιήθηκαν μελέτες προσομοιώσεων Μοριακής Δυναμικής (Molecular Dynamics) σε υδατικό περιβάλλον. Οι μελέτες αυτές επιτρέπουν την εκτίμηση της κίνησης των ατόμων και της μετατόπισης των μορίων συναρτήσει του χρόνου. Έτσι, παρέχονται επιπρόσθετες δομικές πληροφορίες για την ευστάθεια των συμπλόκων σε υδατικό διάλυμα και τη δυναμική συμπεριφορά των επί μέρους μορίων στα υπό εξέταση συστήματα. Επιπλέον, με την εφαρμογή της μεθόδου MM/GBSA έγινε εκτίμηση των θερμοδυναμικών παραμέτρων που σχετίζονται με τη σταθερότητα των προϊόντων εγκλεισμού κατά τη διάρκεια της προσομοίωσης, όπως η μεταβολή της ελεύθερης ενέργειας πρόσδεσης (ΔGGB) η ενθαλπία (ΔΗ) και η εντροπία (ΔS) του συστήματος.

Τέλος, πραγματοποιήθηκαν και φασματομετρικές μελέτες σε ορισμένα προϊόντα εγκλεισμού προκειμένου να μελετηθεί η αύξηση της υδατοδιαλυτότητας των ξενιζομένων μορίων (μελέτες Διαγραμμάτων Διαλυτότητας - Phase Solubility studies). Πιο συγκεκριμένα, μελετήθηκε η αύξηση της υδατοδιαλυτότητας της πιπερίνης παρουσία διαφορετικών ξενιστών (β-CD, τυχαία μεθυλιωμένη β-CD και 2-υδροξυπρόπυλ-β-CD) στους 25 °C και του μυρκενίου παρουσία φυσικής β-CD σε τρεις διαφορετικές θερμοκρασίες (25, 35 και 45 °C). Οι συγκεκριμένες μελέτες επέτρεψαν την εκτίμηση της σταθεράς σύνδεσης Kc και της απόδοσης συμπλοκοποίησης CE (complexation efficiency) ολικά στο διάλυμα, σύμφωνα με τη μέθοδο των Higuchi-Connors. Ειδικά για το μυρκένιο, η πραγματοποίηση των πειραμάτων σε τρεις θερμοκρασίες κατέστησε εφικτό τον συσχετισμό του φυσικού λογαρίθμου της Kc (lnKc) με τον αντίστροφο λόγο της θερμοκρασίας (1/Τ) και τον σχεδιασμό γραφήματος Van’t Hoff (Van`t Hoff plot), από το οποίο έγινε δυνατός ο υπολογισμός των θερμοδυναμικών παραμέτρων του συμπλόκου μυρκενίου/β-CD (ΔG, ΔH και ΔS). Τα αποτελέσματα των υπολογιστικών (MDs) και πειραματικών μεθόδων βρίσκονται σε σχετική συμφωνία, υποδεικνύοντας για την περίπτωση της πιπερίνης ως καταλληλότερο ξενιστή την RM-β-CD, ενώ για το σύμπλοκο εγκλεισμού του μυρκενίου σε β-CD τους 25°C ως καταλληλότερη θερμοκρασία συμπλοκοποίησης .

The aim of the present study is the collection and the elaboration of data that are related to the inclusion compounds of natural components of food in cyclodextrins.

Cyclodextrins (CDs) are well known cyclic oligosaccharides, constituted by d-glucopyranose units connected through α→(1,4) glucosic bonds, having the shape of a truncated cone endowed with a hydrophilic outer periphery and a hydrophobic interior cavity. Due to their shape and amphiphilic properties, CDs have the ability to encapsulate hydrophobic molecules or parts of molecules, inside their cavity, forming non-covalent dynamic inclusion complexes in aqueous solution. In this case cyclodextrins are regarded as “hosts” whereas the encapsulated molecules as “guests”.

The most common CD, used as a host molecule, is the native β-cyclodextrin (β-CD) consisting of seven glucose units. β-CD methylated derivatives, like DM-β-CD [heptakis(2,6-di-O-methyl)-β-cyclodextrin] and TM-β-CD [heptakis(2,3,6-tri-O-methyl)-β-cyclodextrin), obtained by methylation of the β-CD hydroxyl groups in 2, 6 and 2, 3 and 6 positions respectively, are also commonly examined as pertinent hosts, as they offer an elongated hydrophobic cavity, higher solubility and in the case of TM-β-CD more flexibility upon an induce-fit complexation mechanism with the guest molecule.

In this thesis, a thorough structural study of the following thirteen inclusion complexes is presented: Cholesterol/β-CD, Naringenin/DM-β-CD, Naringenin/TM-β-CD, Capsaicin/β-CD, Capsaicin/DM-β-CD, Piperine/β-CD, Piperine/DM-β-CD, Piperine/TM-β-CD, Arachidonic/TM-β-CD, Oleic/β-CD, Linoleic/β-CD, Myrcene/β-CD and Tyrosol/DM-β-CD. The encapsulated molecules cover a variety of chemical categories, such as steroids (cholesterol), flavonoids (naringenin), alkaloids (capsaicin and piperine), fatty acids (arachidonic, oleic and linoleic acid), monoterpenes (myrcene) and finally phenols (tyrosol). In the recent years they are considered to be of great importance for the food industry, in terms of the food quality, nutrition and human health.

Initially, the structure of the examined inclusion complexes was determined by X-ray crystallography. The crystal structures revealed valuable information about the guest:host stoichiometry, the geometrical details of the host-guest conformation and complexation, and the intra- and intermolecular interactions. However, as it is known, the crystal structures are significantly affected by crystal contacts and constitute averages of subsets of possible guest binding modes. In order to overcome these shortcomings, Molecular Dynamics studies (MDs) in aqueous environment were also conducted. The initial models for the MD simulations were based on the crystallographically determined structures. By monitoring the obtained frames during the time frame of the simulations, the dynamical behavior and the stability of the inclusion complexes in aqueous environment was examined. Moreover thermodynamic parameters such as the free energy of the binding of the guest to host (ΔGGB) decomposed into both entropic (ΔS) and enthalpic terms (ΔΗ), were calculated by the MM/GBSA method.

Finally, phase solubility studies of piperine in the presence of three different hosts at 25 °C (β-CD, Randomly Methylated-β-CD and 2-HydroxyPropyl-β-CD) were conducted, in order to estimate by using the Higuchi-Connors method, the inclusion complex type, the stability constant Ks and the Complexation Efficiency (CE), of these inclusion complexes. On the other hand, the solubility of myrcene in aqeous solutions of increased β-CD concentrations at 25, 35 and 45 °C was examined and the thermodynamic parameters (ΔG, ΔH and ΔS) of the myrcene/β-CD complex were calculated from a Van`t Hoff plot (lnKc vs 1/T). The above experimental results are in agreement with the theoretical studies (MD simulations and MM/GBSA calculations) indicating that RM-β-CD is the best host molecule for piperine and the optimum temperature for the myrcene complexation with β-CD is 25 °C.