Study of confectionery industry waste valorisation for microbial oil production via fermentation using oleaginous yeasts

Abstract

This doctoral dissertation focused on the valorisation of renewable resources generated by the food industry for the biotechnological production of microbial oil. Microbial oil has been evaluated as potential feedstock for the production of biodiesel. The first part of this PhD thesis demonstrated that flour-rich waste (FRW) and by-product streams generated by bakery, confectionery and wheat milling plants could be employed as the sole raw materials for generic fermentation media production, suitable for microbial oil synthesis. Wheat milling by-products were used in solid state fermentations (SSF) of Aspergillus awamori for the production of crude enzymes, mainly glucoamylase and protease. Enzyme-rich SSF solids were subsequently employed for hydrolysis of FRW streams into nutrient-rich fermentation media. Batch hydrolytic experiments using FRW concentrations up to 205 g/L resulted in higher than 90% (w/w) starch to glucose conversion yields and 40% (w/w) total Kjeldahl nitrogen to free amino nitrogen conversion yields. Starch to glucose conversion yields of 98.2, 86.1 and 73.4% (w/w) were achieved when initial FRW concentrations of 235, 300 and 350 g/L were employed in fed-batch hydrolytic experiments, respectively. Crude hydrolysates were used as fermentation media in shake flask cultures with the oleaginous yeast Lipomyces starkeyi DSM 70296 reaching a total dry weight of 30.5 g/L with a microbial oil content of 40.4% (w/w), higher than that achieved in synthetic media. Fed-batch bioreactor cultures led to a total dry weight of 109.8 g/L with a microbial oil content of 57.8% (w/w) and productivity of 0.4 g/(L⸱h). This PhD thesis subsequently dealt with the production of crude enzymes via SSF using wheat milling by-products for both fermentation media production using FRW streams and lysis of Rhodosporidium toruloides yeast cells. Filter sterilization of crude hydrolysates was more beneficial than heat sterilization regarding yeast growth and microbial oil production. The initial carbon to free amino nitrogen ratio of crude hydrolysates was optimized (80.2 g/g) in fed-batch cultures of R. toruloides leading to a total dry weight of 61.2 g/L with microbial oil content of 61.8 % (w/w). A feeding strategy where the glucose concentration was maintained in the range of 12.2 – 17.6 g/L led to the highest productivity (0.32 g/L∙h). The crude enzymes produced by SSF were utilised for yeast cell treatment leading to simultaneous release of around 80% of total lipids in the broth and production of a hydrolysate suitable as yeast extract replacement. The next part of the thesis was related to the utilization of diversified mixed confectionery waste streams in a two-stage bioprocess to formulate nutrient-rich fermentation media for microbial oil production. Solid state fermentation was conducted for the production of crude enzyme consortia to be subsequently applied in hydrolytic reactions to break down starch, disaccharides and proteins into monosaccharides, amino acids and peptides. Crude hydrolysates were evaluated in bioconversion processes using R. toruloides DSM 4444 in both batch and fed-batch mode. Under nitrogen-limiting conditions, during fed-batch cultures, the concentration of microbial lipids reached 16.6 – 17.0 g/L with the intracellular content being more than 40% (w/w) in both hydrolysates applied. R. toruloides was able to metabolize mixed carbon sources without catabolite repression. The fatty acid profile of the produced lipids was altered based on the substrate employed in the bioconversion process. Microbial lipids were rich in unsaturated fatty acids, with oleic acid being the major fatty acid (61.7%, w/w). This PhD thesis finally focused on the evaluation of biodiesel production using microbial oil derived from FRW hydrolysates. Crude hydrolyzates were used in fed-batch bioreactor fermentations at a C/FAN ratio of 80.2 g/g with the oleaginous yeast R. toruloides. Microbial oil was transesterified into biodiesel with satisfactory performance considering the European standard EN 14214. This work demonstrated that valorization of food waste for biodiesel production could be feasible.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώθηκε στην αξιοποίηση ανανεώσιμων πρώτων υλών, που προέρχονται από υποπροϊόντα βιομηχανιών τροφίμων για τη βιοτεχνολογική παραγωγή μικροβιακού λίπους. Εξετάστηκε η πιθανή χρήση του παραγόμενου μικροβιακού λίπους ως πρώτη ύλη για την παραγωγή βιοντίζελ. Το πρώτο μέρος της διατριβής έδειξε ότι τα αλευρούχα υπολείμματα (flour-rich-waste-FRW) και τα ρεύματα υποπροϊόντων που προέρχονται από μονάδες αρτοποιίας, ζαχαροπλαστικής και αλέσεως σίτου μπορούν να χρησιμοποιηθούν ως πλήρεις πρώτες ύλες για την παραγωγή θρεπτικών μέσων ζύμωσης, κατάλληλες για τη σύνθεση μικροβιακών λιπιδίων. Τα παραπροϊόντα άλεσης σίτου χρησιμοποιήθηκαν σε ζυμώσεις στερεάς κατάστασης (solid state fermentation-SSF) με το στέλεχος Aspergillus awamori για την παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων, κυρίως γλυκοαμυλάση και πρωτεάση. Τα πλούσια σε ένζυμα στερεά χρησιμοποιήθηκαν στη συνέχεια για την υδρόλυση των FRW προς παραγωγή πλούσιων σε θρεπτικά μέσων ζύμωσης. Οι κλειστού τύπου υδρολύσεις, με την χρήση αρχικών συγκεντρώσεων FRW έως και 205 g/L είχαν ως αποτέλεσμα αποδόσεις μετατροπής αμύλου σε γλυκόζη υψηλότερες από 90% (w/w) και σε 40% (w/w) απόδοση μετατροπής ολικού αζώτου (Kjeldahl) προς ελεύθερες αμινομάδες αμινοξέων και πεπτιδίων (free amino nitrogen-FAN). Αποδόσεις μετατροπής αμύλου σε γλυκόζη ίσες με 98,2%, 86,1% και 73,4% (w/w), επιτεύχθηκαν σε αντίστοιχες αρχικές συγκεντρώσεις FRW 235 g/L, 300 g/L και 350 g/L μέσω ενζυμικών υδρολύσεων ημισυνεχούς λειτουργίας. Εν συνεχεία, τα υδρολύματα που προέκυψαν από τις ενζυμικές υδρολύσεις των FRW χρησιμοποιήθηκαν ως θρεπτικό υπόστρωμα ζύμωσης προς παραγωγή μικροβιακού λίπους με την ζύμη Lipomyces starkeyi DSM 70296. Η παραγωγή μικροβιακής βιομάζας (total dry weight-TDW) που επιτεύχθηκε ήταν 30,5 g/L με λιποπεριεκτικότητα 40,4% (w/w), τιμές υψηλότερες από τις αντίστοιχες που προέκυψαν με την χρήση συνθετικών θρεπτικών μέσων. Οι ζυμώσεις ημισυνεχούς καλλιέργειας σε βιοαντιδραστήρα οδήγησαν σε TDW 109,8 g/L με λιποπεριεκτικότητα 57,8% (w/w) και παραγωγικότητα 0,4 g/(L⸱h). Το επόμενο μέρος της διδακτορικής διατριβής αφορούσε στην παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων μέσω SSF χρησιμοποιώντας παραπροϊόντα άλεσης σίτου τόσο για την παραγωγή θρεπτικών μέσων ζύμωσης αξιοποιώντας FRW, όσο και για τη λύση των κυττάρων ζύμης του στελέχους Rhodosporidium toruloides. Η αποστείρωση με φίλτρο των ακατέργαστων παραγόμενων υδρολυμάτων ήταν ευεργετικότερη σε σύγκριση με την θερμική αποστείρωση όσον αφορά στην ανάπτυξη ζύμης και στην παραγωγή μικροβιακών λιπιδίων. Η αρχική αναλογία άνθρακα προς FAN των ακατέργαστων υδρολυμάτων βελτιστοποιήθηκε (80,2 g/g) σε ζυμώσεις ημισυνεχούς καλλιέργειας του R. toruloides, οδηγώντας σε TDW 61,2 g/L με λιποπεριεκτικότητα 61,8% (w/w). Με την εφαρμογή μιας στρατηγική τροφοδοσίας κατά την οποία η συγκέντρωση γλυκόζης διατηρήθηκε σε εύρος 12,2 - 17,6 g/L επιτεύχθηκε η υψηλότερη τιμή παραγωγικότητας (0,32 g/(L⸱h)). Τα ακατέργαστα ένζυμα που παράχθηκαν μέσω SSF χρησιμοποιήθηκαν για την επεξεργασία των κυττάρων της ζύμης οδηγώντας σε ταυτόχρονη απελευθέρωση περίπου 80% των συνολικών λιπιδίων στο υγρό της ζύμωσης και σε παραγωγή ενός υδρολύματος ως υποκατάστατο εκχυλίσματος ζύμης. Το επόμενο στάδιο της εργασίας αφορούσε την αξιοποίηση μικτών παραπροϊόντων ζαχαροπλαστικής σε βιοδιεργασία δύο σταδίων προς παραγωγή ενός πλούσιου σε θρεπτικά συστατικά μέσου ζύμωσης κατάλληλου για την παραγωγή μικροβιακού λίπους. Αρχικά διεξήχθη ζύμωση στερεής κατάστασης για την παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων που στην συνέχεια χρησιμοποιήθηκαν σε υδρολυτικές αντιδράσεις για την διάσπαση του αμύλου, δισακχαριτών και πρωτεϊνών σε μονοσακχαρίτες, αμινοξέα και πεπτίδια. Τα παραγόμενα υδρολύματα αξιολογήθηκαν σε διεργασίες βιομετατροπής με την χρήση της ζύμης R. toruloides DSM 4444 σε ζυμώσεις κλειστής καλλιέργειας και ημισυνεχούς καλλιέργειας. Υπό συνθήκες περιορισμού του αζώτου, κατά τη διάρκεια ημισυνεχών ζυμώσεων, η συγκέντρωση των μικροβιακών λιπιδίων κυμάνθηκε από 16,6 έως 17,0 g/L με το ενδοκυτταρικό περιεχόμενο να είναι μεγαλύτερο του 40% (w/w). Το στέλεχος της ζύμης ήταν ικανό να μεταβολίζει τις μικτές πηγές άνθρακα χωρίς καταστολή του καταβολισμού. Το προφίλ λιπαρών οξέων των παραγόμενων λιπιδίων μεταβλήθηκε με βάση το υπόστρωμα που χρησιμοποιήθηκε στη διαδικασία βιομετατροπής. Τα μικροβιακά λιπίδια ήταν πλούσια σε ακόρεστα λιπαρά οξέα, με το ελαϊκό οξύ να είναι το κύριο λιπαρό οξύ (61,7%, w/w). Το τελευταίο μέρος αυτής της διπλωματικής εργασίας περιελάμβανε την αξιολόγηση της παραγωγής βιοντίζελ χρησιμοποιώντας μικροβιακό λίπος που προέρχεται από υδρολύματα FRW. Χρησιμοποιήθηκαν ακατέργαστα υδρολύματα σε ζυμώσεις βιοαντιδραστήρων ημισυνεχούς λειτουργίας σε αναλογία C/FAN 80,2 g/g με το στέλεχος ζύμης R. toruloides. Το μικροβιακό λίπος μετεστεροποιήθηκε σε βιοντίζελ με ικανοποιητικές επιδόσεις λαμβάνοντας υπόψη το ευρωπαϊκό πρότυπο EN 14214. Αυτή η εργασία έδειξε ότι η αξιοποίηση των απορριμμάτων τροφίμων για την παραγωγή βιοντίζελ μπορεί να είναι εφικτή.