The aim of this thesis was to unravel the microecosystem composition of 13 spontaneously fermented wheat sourdoughs, originating from regions of Greece not previously assessed, via the combination of culture dependent and independent approaches. Then, further investigation of the technological and safety attributes of the associated microbiota was performed, for potential application of the sourdough isolates as starters or adjunct cultures in food fermentations.
In the first study, the microbial ecology of the 13 Greek wheat sourdoughs was identified by combining both culture dependent and independent approaches. Regarding the culture dependent method, conventional plating, clustering by Polymerase Chain Reaction-Random Amplified Polymorphic DNA (PCR-RAPD), identification by PCR species-specific for Lactiplantibacillus plantarum and 16S and 26S rRNA gene sequencing for lactic acid bacteria (LAB) and yeasts, respectively, were applied. On the other hand, culture independent approach included DNA and RNA-based PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis (DGGE) analysis of sourdough samples. Results obtained, revealed that LAB populations ranged between 6.28-9.20 log CFU/ g, with Lp. plantarum and Levilactobacillus brevis dominating or co-dominating in the majority of cases. Companilactobacillus paralimentarius, Fructilactobacillus sanfranciscensis, Latilactobacillus sakei, Lt. curvatus, Lv. zymae, Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum and Leu. mesenteroides were detected, as well. In the case of yeasts, their population ranged between 4.60-6.32 log CFU/ g and consisted mostly of Saccharomyces cerevisiae, while the presence of Pichia membranifaciens, Pi. fermentans, Wickerhamomyces anomalus and Kazachstania humilis was also recorded. Despite the fact that RNA and DNA-based PCR-DGGE analysis yielded the same microbial profiles, overall PCR-DGGE analysis only partially verified the sourdough microecosystem composition, as depicted by culture dependent approach.
In a further study, a wide set of technological and safety attributes of the sourdough derived LAB and yeasts, were assessed. The under study properties included proteolysis, lipolysis, amylolysis, amino acid decarboxylase, phytase activity, antimicrobial capacity and exopolysaccharide (EPS) production of both LAB and yeasts. Strains exhibited proteolytic, lipolytic and antimicrobial activities, which were initially screened by the well diffusion assay (WDA). Seven LAB and 8 yeast strains hydrolyzed gluten, while 11 LAB were considered lipolytic. In the former case, further Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) analysis of gluten fractions was applied, which resulted in partial and strain dependent gluten degradation. In the latter case, a subsequent lipolysis kinetics over 21 days revealed increased fluctuation of enzyme activities, among the different strains under study. Regarding the antimicrobial activity assessment, 13 LAB and 12 yeast strains exhibited inhibitory activity against different molds, which was attributed to non-proteinaceous metabolites. In addition, 21 Lp. plantarum strains revealed antibacterial activity against a mixture of Listeria monocytogenes strains, belonging to serotype 4b, while the protein nature of the inhibitory compounds was verified, as well. Among them, three W. anomalus strains (LQC 10346, 10353, 10360) and 6 Lp. plantarum strains (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516, 2520), which exhibited more than one technological or safety property, worth further investigation.
The three aforementioned sourdough derived W. anomalus strains, namely LQC 10346, 10353 and 10360, which were previously found to produce antimold metabolites of non-protein nature, were further subjected to antimold activity assessment both in vitro and in situ. For that purpose, the yeast strains were grown at 30 oC for 24 h in two substrates; the former was Brain Heart Infusion (BHI) broth adjusted to 6 initial pH values (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0) and 6 NaCl concentrations (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5%), while the latter was liquid dough supplemented with the aforementioned 6 NaCl concentrations. WDA revealed that the maximum inhibitory activity was 5120 AU/ mL, obtained by all three strains after growth in both substrates. Then, the responsible volatile compounds were identified by solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry (SPME-GC-MS), among which ethanol, ethyl acetate, isoamyl alcohol and isoamyl acetate were detected in all samples assessed. In the case of antimold activity assessment of pure volatile organic compounds (VOCs), the lower minimum inhibitory concentrations (MICs) were recorded for 2,4-di-tert-butyl-phenol and benzaldehyde (0.04 and 0.06 µL/ mL of headspace, respectively). Finally, the breads produced either with monocultures of W. anomalus strains or with their co-culture with baker’s yeast gained additional mold free shelf life, ranging from 9 to 30 days, compared to the control.
In a next study, 6 sourdough derived bacterial strains, namely LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 and 2520, the identity of which was initially assigned to Lp. plantarum by 16S rRNA gene sequencing, were further subjected to whole genome sequencing, due to their technological and safety properties. Thus, the raw sequence reads were quality checked, then de novo assembly was performed (assembly of reads into contigs), further organization of contigs to scaffolds occurred and finally scaffolds were annotated. Taxonomic classification of the aforementioned strains revealed their assignment to Lp. plantarum subsp. argentoratensis. Good quality of both assembled scaffolds and genomes after annotation was exhibited. The total size of genomes ranged within 3.13-3.49 Mb, while the number of protein-coding and the non-coding genes ranged within 3091-3492 and 160-231, respectively.
Given that there has been no previous report on the bioinformatic genome analysis of sourdough derived Lp. plantarum subsp. argentoratensis strains, the aim of the present study was to bioinformatically analyze and compare the genomes of the 6 bacterial strains, belonging to the subspecies argentoratensis (namely LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 and 2520). Analysis related to their biotechnological potential revealed that the 6 LAB strains possessed the genes associated with carbohydrate metabolism, membrane transport, metabolism of specific organic acids (namely conversion of citrate to oxaloacetate), acetoin biosynthesis, riboflavin and folate production. Regarding the genomic aspects concerning the food safety, the bioinformatic analysis performed revealed no pathogenic factors, but the presence of antibiotic resistance genes was detected. In addition, the 6 Lp. plantarum subsp. argentoratensis strains were considered negative producers for the majority of biogenic amines, however the detection of cadA encoding cadaverine production, worth’s further phenotypical assessment. As far as the stability of genomes was concerned, the presence of plasmids, insertion sequences, prophage regions and CRISPRcas systems was recorded. Finally, all 6 bacterial strains were plantaricin producers.
In previous studies, the 6 Lp. plantarum strains, namely LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 and 2520, were reported to exert antibacterial activity, due to the production of proteinaceous metabolites, while the presence of a set of genes encoding plantaricins in their genomes was recorded, as well. Thus, the aim of this study was to assess the effect of sourdough related parameters on the plantaricin activity and the transcriptomic response of the plantaricin genes in the 6 Lp. plantarum strains. Sourdough related parameters included 3 substrates: de Mann Rogosa and Sharpe (MRS) broth, MRS broth containing the type and amount of carbohydrates found in wheat flour, wheat flour and water extract fortified with carbohydrates to the initial flour concentration; 3 temperatures (20, 30, 37 oC); 2 initial pH values (5.0, 6.0); 2 NaCl concentrations (0.0, 1.8%); 12 time points (ranging from 0 to 33 h); 6 Lp. plantarum strains. The plantaricin activity was exerted in a strain dependent manner. More accurately, the 6 strains were discriminated in two groups in terms of phenotypic features and organization of the pln locus. Analysis of variance revealed that growth substrate, temperature, initial pH value and strains had significant effect on plantaricin activity, while NaCl had only marginal effect. Regarding the transcriptomic response of plantaricin genes, both temperature and substrate had a more significant effect on the relative gene transcription, compared to the respective of initial pH value. Weak correlation was recorded between phenotypic assessment and relative gene transcription.
Στόχος της παρούσας διπλωματικής μελέτης ήταν να διερευνηθεί η σύσταση του μικρο-οικοσυστήματος 13 προζυμιών σίτου αυθόρμητης ζύμωσης, τα οποία έχουν συλλεχθεί από περιοχές της Ελλάδας, που δεν έχουν μελετηθεί έως τώρα. Για τον λόγο αυτόν, επιλέχθηκαν τόσο κλασικές μέθοδοι όσο και ανεξάρτητες της καλλιέργειας προσεγγίσεις. Στη συνέχεια, διεξήχθη περαιτέρω διερεύνηση των μεταβολικών δράσεων των απομονωθέντων μικροοργανισμών, που σχετίζονται με την τεχνολογία και την ασφάλεια παρασκευής των άρτων, με στόχο την πιθανή εφαρμογή τους ως εναρκτήριες ή συμπληρωματικές καλλιέργειες σε ζυμώσεις τροφίμων.
Στην πρώτη μελέτη, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση της μικροβιακής οικολογίας των 13 ελληνικών προζυμιών σίτου, συνδυάζοντας κλασικές τεχνικές καθώς και προσεγγίσεις που δεν στηρίζονται στην καλλιέργεια. Όσον αφορά στην κλασική μέθοδο, εφαρμόστηκε η συμβατική καλλιέργεια σε τρυβλία, ομαδοποίηση με πολυμορφισμούς τυχαίως πολλαπλασιασμένου DNA βασισμένο σε αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR-RAPD), ταυτοποίηση μέσω εξειδικευμένης PCR για το είδος Lactiplantibacillus plantarum, καθώς και αλληλούχιση του 16S και 26S rRNA γονιδίου για οξυγαλακτικά βακτήρια και ζύμες, αντίστοιχα. Από την άλλη πλευρά, η μη κλασική προσέγγιση περιλάμβανε ανάλυση με ηλεκτροφόρηση βαθμιδωτής αποδιάταξης βασισμένη σε PCR (PCR-DGGE), με άμεση εκχύλιση τόσο του DNA όσο και του RNA των δειγμάτων προζυμιού. Η ανάλυση των αποτελεσμάτων έδειξε ότι ο πληθυσμός των οξυγαλακτικών βακτηρίων κυμάνθηκε μεταξύ 6.28-9.20 log CFU/ g, με τους Lp. plantarum και Levilactobacillus brevis να επικρατούν ή να συνεπικρατούν στην πλειονότητα των περιπτώσεων. Επίσης, ταυτοποιήθηκαν και τα είδη Companilactobacillus paralimentarius, Fructilactobacillus sanfranciscensis, Latilactobacillus sakei, Lt. curvatus, Lv. zymae, Lactococcus lactis, Leuconostoc citreum και Leu. mesenteroides. Στην περίπτωση των ζυμών, ο πληθυσμός τους κυμάνθηκε μεταξύ 4.60-6.32 log CFU/ g και αποτελούνταν κυρίως από Saccharomyces cerevisiae, ενώ καταγράφθηκε και η παρουσία των Pichia membranifaciens, Pi. fermentans, Wickerhamomyces anomalus και Kazachstania humilis. Παρά το γεγονός ότι η PCR-DGGE ανάλυση με βάση το DNA ή το RNA απέδωσε παρόμοια μικροβιακά προφίλ, η συνολική PCR-DGGE ανάλυση επαλήθευσε μόνο εν μέρει τη σύσταση του μικρο-οικοσυστήματος του προζυμιού, όπως αποτυπώθηκε με την κλασική μέθοδο.
Σε επόμενη μελέτη, τα οξυγαλακτικά βακτήρια και οι ζύμες που απομονώθηκαν από ελληνικά προζύμια, αξιολογήθηκαν ως προς μία σειρά ιδιοτήτων, οι οποίες σχετίζονται με την τεχνολογία και την ασφάλεια παρασκευής των άρτων. Οι υπό μελέτη ιδιότητες περιλάμβαναν την πρωτεόλυση, λιπόλυση, αμυλόλυση, παρουσία αποκαρβοξυλάσης αμινοξέων, δραστηριότητα φυτάσης, αντιμικροβιακή ικανότητα και παραγωγή EPS τόσο από οξυγαλακτικά όσο και από ζύμες. Τα στελέχη εμφάνισαν πρωτεολυτικές, λιπολυτικές και αντιμικροβιακές δράσεις, οι οποίες αρχικά εξετάστηκαν με τη μέθοδο διάχυσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (WDA). Επτά οξυγαλακτικά βακτήρια και 8 ζύμες ήταν ικανά να υδρολύσουν τη γλουτένη, ενώ 11 οξυγαλακτικά βακτήρια χαρακτηρίστηκαν από παρουσία λιπολυτικής δράσης. Στην πρώτη περίπτωση, εφαρμόστηκε περαιτέρω ανάλυση με τη μέθοδο ηλεκτροφόρησης των πρωτεϊνών σε πηκτή πολυακρυλαμιδίου με δωδέκυλο-θειικό νάτριο (SDS-PAGE) των κλασμάτων της γλουτένης, η οποία έδειξε μερική και εξαρτώμενη από το στέλεχος υδρόλυση της γλουτένης. Στην περίπτωση της λιπόλυσης, μια επακόλουθη κινητική λιπόλυσης σε διάστημα 21 ημερών αποκάλυψε αυξημένη διακύμανση της ενζυμικής δραστηριότητας, μεταξύ των υπό μελέτη στελεχών. Όσον αφορά στην αξιολόγηση της αντιμικροβιακής δραστηριότητας, 13 στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων και 12 στελέχη ζυμών παρουσίασαν παρεμποδιστική δράση ως προς την ανάπτυξη διαφορετικών μυκήτων, η οποία αποδόθηκε σε μη πρωτεϊνικούς μεταβολίτες. Επιπλέον, 21 στελέχη Lp. plantarum εμφάνισαν αντιβακτηριακή δράση εναντίον ενός μίγματος 5 στελεχών Listeria monocytogenes, που ανήκουν στον ορότυπο 4b, ενώ επαληθεύτηκε και η πρωτεϊνική φύση των παρεμποδιστικών ενώσεων. Μεταξύ των παραπάνω, 3 στελέχη W. anomalus (LQC 10346, 10353, 10360) και 6 στελέχη Lp. plantarum (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516, 2520), τα οποία εμφάνισαν περισσότερες από μία ιδιότητες, αξίζουν περαιτέρω έρευνας.
Τα τρία στελέχη W. anomalus, συγκεκριμένα τα LQC 10346, 10353 και 10360, για τα οποία η παραγωγή αντιμυκητιακών ενώσεων μη πρωτεϊνικής φύσης καταγράφθηκε σε προηγούμενη μελέτη, υποβλήθηκαν σε περαιτέρω αξιολόγηση της παρεμποδιστικής τους δράσης τόσο in vitro όσο και in situ. Για το σκοπό αυτό, τα στελέχη ζυμών αναπτύχθηκαν στους 30 oC για 24 ώρες σε δύο υποστρώματα. Το πρώτο ήταν υγρό θρεπτικό υπόστρωμα BHI προσαρμοσμένο σε 6 αρχικές τιμές pH (3.5, 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0) και 6 συγκεντρώσεις NaCl (0.0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5%), ενώ το δεύτερο ήταν ένα υγρό ζυμάρι ενισχυμένο με τις προαναφερθείσες συγκεντρώσεις NaCl. Τα αποτελέσματα της διάχυσης σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα έδειξαν ότι η μέγιστη ανασταλτική δράση ποσοτικοποιήθηκε σε 5120 AU/ mL, η οποία παρουσιάστηκε και από τα τρία στελέχη μετά από ανάπτυξη και στα δύο υποστρώματα. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε ταυτοποίηση των πτητικών ενώσεων με SPME-GC-MS, μεταξύ των οποίων ανιχνεύθηκε αιθανόλη, οξικός αιθυλεστέρας, ισοαμυλική αλκοόλη και οξικός ισοαμυλεστέρας, σε όλα τα δείγματα που αξιολογήθηκαν. Στην περίπτωση της αξιολόγησης της παρεμποδιστικής δράστης των καθαρών πτητικών ενώσεων εναντίον της ανάπτυξης του μύκητα, οι χαμηλότερες τιμές ελάχιστης παρεμποδιστικής δράσης καταγράφηκαν για τις 2,4-δι-τριτ-βουτυλ-φαινόλη και βενζαλδεΰδη (0,04 και 0,06 µL/ mL ελεύθερου χώρου, αντίστοιχα). Τέλος, οι άρτοι που παρήχθησαν είτε με μονοκαλλιέργειες στελεχών W. anomalus είτε με τη συγκαλλιέργειά τους με μαγιά αρτοποιίας απέκτησαν πρόσθετη διάρκεια ζωής, που κυμάνθηκε από 9 έως 30 ημέρες, σε σύγκριση με το μάρτυρα.
Σε επόμενη μελέτη, 6 στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων απομονωθέντων από προζύμια, συγκεκριμένα τα LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 και 2520, τα οποία αρχικά ταυτοποιήθηκαν ως Lp. plantarum μέσω αλληλούχισης του 16S rRNA γονιδίου, επιλέχθηκαν για περαιτέρω αλληλούχιση ολόκληρου του γονιδιώματός τους, λόγω ιδιοτήτων, που σχετίζονται με την τεχνολογία και την ασφάλεια παρασκευής των άρτων. Τα ακατέργαστα τμήματα των αλληλουχιών ελέγχθηκαν ποιοτικά, στη συνέχεια πραγματοποιήθηκε de novo (χωρίς τη χρήση γονιδιώματος αναφοράς) συναρμολόγησή τους σε μια συνεχόμενη γονιδιωματική αλληλουχία (contigs), στην οποία η σειρά των βάσεων είναι γνωστή με υψηλό επίπεδο εμπιστοσύνης. Τέλος, οι συναρμολογηθείσες αλληλουχίες οργανώθηκαν σε ακόμη μεγαλύτερα τμήματα (scaffolds), χρησιμοποιώντας μία γνωστή και ολοκληρωμένη αλληλουχία (completed genome) ως γονιδίωμα αναφοράς (reference-based scaffolding). Μετά την οργάνωση των αλληλουχιών, πραγματοποιήθηκε ο εντοπισμός των γονιδίων μέσα στις αλληλουχίες DNA (genome annotation). Η ταξινόμηση των προαναφερθέντων στελεχών αποκάλυψε ότι ανήκαν στο υποείδος Lp. plantarum subsp. argentoratensis. Η ποιοτική ανάλυση των συναρμολογημένων μη ολοκληρωμένων γονιδιωμάτων (draft genomes) και του εντοπισμού των γονιδίων έδειξε ότι τα αυτά ήταν υψηλής ποιότητας. Το συνολικό μέγεθος των γονιδιωμάτων κυμάνθηκε μεταξύ 3,13-3,49 Mb, ενώ ο αριθμός των γονιδίων που κωδικοποιούν πρωτεΐνες και των αντίστοιχων που δεν κωδικοποιούν πρωτεΐνες κυμάνθηκε μεταξύ 3091-3492 και 160-231, αντίστοιχα.
Δεδομένου ότι δεν έχει υπάρξει προηγούμενη αναφορά σε βιοπληροφορική ανάλυση γονιδιώματος του στελέχους Lp. plantarum subsp. argentoratensis απομονωθέντος από προζύμι, σκοπός της συγκεκριμένης μελέτης ήταν η βιοπληροφορική ανάλυση και σύγκριση των γονιδιωμάτων 6 βακτηριακών στελεχών (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 και 2520), τα οποία ανήκουν στο υποείδος argentoratensis. Η ανάλυση που σχετίζεται με το βιοτεχνολογικό τους δυναμικό αποκάλυψε ότι στα 6 στελέχη οξυγαλακτικών βακτηρίων καταγράφθηκαν τα γονίδια που σχετίζονται με το μεταβολισμό των υδατανθράκων, το σύστημα μεταφοράς διαφόρων ουσιών μέσω της κυτταρικής μεμβράνης, το μεταβολισμό συγκεκριμένων οργανικών οξέων, όπως για παράδειγμα τη μετατροπή του κιτρικού σε οξαλοξικό, τη βιοσύνθεση ακετοΐνης καθώς και την παραγωγή ριβοφλαβίνης και φολικού οξέος. Όσον αφορά στις γονιδιωματικές πτυχές που σχετίζονται με την ασφάλεια των τροφίμων, η βιοπληροφορική ανάλυση που πραγματοποιήθηκε δεν αποκάλυψε παθογόνους παράγοντες, ωστόσο ανιχνεύθηκε η παρουσία γονιδίων με ανθεκτικότητα στα αντιβιοτικά. Επιπλέον, τα 6 στελέχη Lp. plantarum subsp. argentoratensis αξιολογήθηκαν αρνητικά ως προς τη δυνατότητα παραγωγής της πλειονότητας των βιογενών αμινών. Παρόλα αυτά, η ανίχνευση του γονιδίου cadA που κωδικοποιεί την παραγωγή καδαβερίνης, αξίζει περαιτέρω έρευνα σε φαινοτυπικό επίπεδο. Σχετικά με τη σταθερότητα των γονιδιωμάτων, σημειώθηκε η παρουσία διαφόρων κινητών/ μετακινούμενων γενετικών στοιχείων (Mobile Genetic Elements - MGEs), όπως είναι για παράδειγμα τα πλασμίδια, μικρές αλληλουχίες DNA (instertion sequences - IS) που κινούνται εντός ή μεταξύ των γονιδιωμάτων χρησιμοποιώντας τα δικά τους εξιδεικευμένα συστήματα ανασυνδυασμού (recombination systems), οι προφάγοι (γονιδίωμα βακτηριοφάγου ενσωματωμένο στο βακτηριακό γονιδίωμα) και συστημάτων CRISPRcas (αλληλουχίες DNA που παίζουν ρόλο στην άμυνα του μικροοργανισμού). Τέλος, και τα 6 βακτηριακά στελέχη αξιολογήθηκαν θετικά ως προς την παραγωγή πλανταρισινών.
Σε προηγούμενες μελέτες, τα 6 στελέχη Lp. plantarum (LQC 2320, 2422, 2441, 2485, 2516 και 2520) χαρακτηρίστηκαν από αντιβακτηριακή δράση, λόγω της παραγωγής μεταβολιτών πρωτεϊνικής φύσης, ενώ καταγράφηκε και η παρουσία ενός συνόλου γονιδίων στο γονιδίωμά τους που κωδικοποιούν πλανταρισίνες. Επομένως, στόχος αυτής της μελέτης ήταν να αξιολογηθεί η επίδραση των παραμέτρων που σχετίζονται με την παρασκευή προζυμιού στην ενεργότητα των πλανταρισινών και στη μεταγραφική απόκριση των γονιδίων που τις κωδικοποιούν, στα 6 στελέχη Lp. plantarum. Οι παράμετροι που σχετίζονται με την παρασκευή προζυμιού περιλάμβαναν 3 υποστρώματα: υγρό θρεπτικό υπόστρωμα MRS, υγρό θρεπτικό υπόστρωμα MRS που περιέχει τον τύπο και την ποσότητα υδατανθράκων που απαντώνται στο αλεύρι σίτου, εκχύλισμα αλεύρου-νερού ενισχυμένο με υδατάνθρακες στην αρχική συγκέντρωση του αλεύρου˙ 3 θερμοκρασίες (20, 30, 37 oC)˙ 2 αρχικές τιμές pH (5.0, 6.0)˙ 2 συγκεντρώσεις NaCl (0.0, 1.8%)˙ 12 χρονικά σημεία (από 0 έως 33 ώρες)˙ 6 Lp. plantarum στελέχη. Τα αποτελέσματα έδειξαν διαφορετικό τρόπο δράσης των πλανταρισινών ανάλογα με το στέλεχος. Πιο αναλυτικά, τα 6 στελέχη διακρίθηκαν σε δύο ομάδες όσον αφορά στα φαινοτυπικά χαρακτηριστικά και στην οργάνωση του pln γενετικού τόπου. Η ανάλυση διακύμανσης αποκάλυψε ότι το μέσο ανάπτυξης, η θερμοκρασία, η αρχική τιμή pH και το στέλεχος είχαν σημαντική επίδραση στη δραστηριότητα των πλανταρισινών, ενώ το NaCl είχε μόνο οριακή επίδραση. Αναφορικά με τη μεταγραφική απόκριση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πλανταρισίνες, τόσο η θερμοκρασία όσο και το υπόστρωμα είχαν πιο σημαντική επίδραση στη σχετική γονιδιακή μεταγραφή, σε σύγκριση με την αντίστοιχη της αρχικής τιμής pH. Ασθενής συσχέτιση καταγράφηκε μεταξύ της φαινοτυπικής αξιολόγησης και της σχετικής γονιδιακής μεταγραφής.
