Identification and Control of Alicyclobacillus acidoterrestris in fruit juices by Ultra High Pressure processing

Abstract

Fruit juices have an important place in humans’ healthy diet. They are considered to be shelf stable products due to their low pH that prevents the growth of most bacteria. However thermo-acidophilic endospore forming bacteria of the genus Alicyclobacillus have the potential to cause spoilage of commercially pasteurized fruit juices. The flat sour type spoilage, with the presence of chemical taint compounds (mostly guaiacol) and the ability of Alicyclobacillus spores to survive after pasteurization and germinate under favorable conditions make them a major concern for the fruit juice industry worldwide. Their special characteristics and occurence in the fruit juice industry has made their early detection a challenge for the manufacturers in order to reduce economic loss. Furthermore, the development of control methods targeting the inactivation of Alicyclobacillus is of paramount importance, as well. High Hydrostatic Pressure has been highlighted as the most important nonthermal technology to ensure microbiological safety and nutritional quality of fruit juices. Moreover, with the combination of moderate to high temperatures it has been proved effective for the inactivation of bacterial spores. Therefore, the objective of this thesis was to investigate the presence of Alicyclobacillus in fruit juices, the identification of isolated colonies with molecular techniques and the examination of their potential to produce guaiacol. Furthermore, HHP was employed in order to study the inactivation of Alicyclobacillus acidoterrestris spores and vegetative cells in orange and peach juice immediately after treatment and throughout storage at various temperatures. Initially, the microbiological quality of commercially available orange and peach juices was undertaken with main focus on the occurrence of Alicyclobacillus species (Chapter 2). For this reason, refrigerated or pasteurized orange and peach juices obtained from the Greek market were analyzed physiochemically and microbiologically. The microbiological analysis aimed to enumerate the main spoilage microorganisms of fruit juices in terms of total viable counts (TVC), lactic acid bacteria (LAB), yeasts, molds and Alicyclobacillus spp., whereas physicochemical analysis included the pH and total soluble solids (TSS) measurement. Results showed low contamination level of the examined fruit juices from spoilage microorganisms, but confirmed the presence of Alicyclobacillus. In Chapter 3, the isolated colonies of Alicyclobacillus that were confirmed according to the IFU method developed by the Working Group on Microbiology of the International III Federation of Fruit Juice Producers, were analyzed with 16S rDNA PCR-RFLP with the use of three restriction endonucleases (HhaI, RSa I and HiNFI), for rapid identification. Furthermore, all isolated Alicyclobacillus colonies were checked for the ability to produce guaiacol. The results of PCR-RFLP grouped the isolates to 8 clusters and 7 of them were different from the used reference strain. Moreover, all isolates had the ability to produce guaiacol. In order to identify the isolates at species level a single enzyme PCR-RFLP method was utilized. A total of 78 Alicyclobacillus isolates were subjected to PCR-RFLP analysis using universal primers for the amplification of V1-V3 variable region of 16S rRNA gene and restriction endonuclease HhaI. Using these specific conditions of the PCR RFLP assay, the A. acidoterrestris isolates were successfully differentiated from A. acidocaldarius and A. hesperidum. The presence of A. acidoterrestris in fruit juices can lead to major spoilage problems. Therefore, the effectiveness of HHP for the inactivation of A. acidoterrestris was investigated in Chapter 4. In order to determine the HHP conditions that could inactivate the spores of the microorganisms, two A. acidoterrestris strains inoculated in orange juice were subjected to temperature-assisted HHP at 500 and 600 MPa in combination with different temperature regimes (25, 45, 60, and 70 °C) for pressurization time up to 30 min (1, 3, 5, 15 and 30 min). Furthermore, the inactivation kinetics of bacterial spores was described by means of the Weibull model. Results demonstrated that spore inactivation increased as high pressure and temperature levels increased. For both strains, complete spore inactivation was achieved during processing at the highest pressure (600 MPa) and temperature (70 ℃). Moreover, the inactivation of A. acidoterrestris spores could be successfully described by the Weibull model for different pressurization levels and temperatures, although strain variability should be taken into consideration. Even though the inactivation of A. acidoterrestris spores has been studied extensively during HHP treatment, however the dynamics of the spores and vegetative cells during storage (after HHP treatment) has not been substantiated thoroughly. Therefore, in Chapter 5, orange juice samples inoculated with the spores of the two different A. acidoterrestris strains used in the study were subjected to HHP treatment at 600 MPa/ 60 °C for 5 and 10 min. HHP treated and untreated samples were subsequently stored at 4, 12, and 25 ℃ for 60 days. Samples were analyzed every week in order to investigate the dynamic of the spore and vegetative cell population during storage. Results demonstrated that the germination of the surviving spores could be inhibited, while the remaining vegetative cells could be IV eliminated throughout storage at low temperatures, although strain variability should be taken into consideration. Furthermore, the spores of the reference strain A. acidoterrestris ATCC 49025 were inoculated in peach juice samples in order to examine the dynamic of the spore and vegetative cell population at higher storage temperatures. For this reason, samples were treated with HHP at 500 and 600 MPa, combined with 25, 45 and 60 °C for 10 min. HHP treated and control samples of peach juice were then stored at isothermal conditions (25, 35 and 45 °C) and analyzed microbiologically for up to 240 h. The outcome of this study was that HHP treatment at 600 MPa/ 60°C /10 min could eliminate the spore population during subsequent storage at 25 °C, whereas the vegetative cell population could be inhibited with the same treatment at the selected storage temperatures.

Οι χυμοί φρούτων κατέχουν σημαντική θέση στην υγιεινή διατροφή του ανθρώπου. Θεωρούνται ασφαλή προϊόντα ραφιού λόγω της χαμηλής τιμής του pH που αποτρέπει την ανάπτυξη των περισσοτέρων βακτηρίων. Παρόλα αυτά θερμοανθεκτικά και οξυανθεκτικά σπορογόνα βακτήρια του γένους Alicyclobacillus είναι πιθανόν να προκαλέσουν την αλλοίωση των παστεριωμένων χυμών φρούτων. Η αλλοίωση χωρίς την εμφανή διόγκωση της συσκευασίας λόγω παραγωγής αερίων αλλά η παρουσία χημικών ενώσεων αλλοίωσης (κυρίως γουαϊακόλης) και η ικανότητα των σπορίων του βακτηρίου Alicyclobacillus να επιβιώνουν μετά την παστερίωση και να εκβλαστάνουν κάτω από ευνοϊκές συνθήκες, τα καθιστούν μείζων πρόβλημα για την βιομηχανία χυμών φρούτων παγκοσμίως. Τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά τους και η παρουσία τους στη βιομηχανία φρουτοχυμών, καθιστά την έγκαιρη ανίχνευση τους μεγάλη πρόκληση για την ελαχιστοποίηση οικονομικών απωλειών. Επιπρόσθετα πρωταρχικής σημασίας είναι η ανάπτυξη μεθόδων ελέγχου με στόχο την αδρανοποίηση των σπορίων και των βλαστικών μορφών του βακτηρίου Alicyclobacillus. Η υπερυψηλή υδροστατική πίεση έχει χαρακτηριστεί ως η σημαντικότερη τεχνολογία μη θερμικής επεξεργασίας , η οποία μπορεί να διασφαλίσει τη μικροβιακή ασφάλεια και τη θρεπτική αξία των χυμών φρούτων. Επιπλέον, σε συνδυασμό με μέτριες έως υψηλές θερμοκρασίες η υπερυψηλή πίεση έχει αποδειχθεί αποτελεσματική στην αδρανοποίηση βακτηριακών σπορίων. Συνεπώς, ο σκοπός της εν λόγω διδακτορικής διατριβής ήταν αρχικά η διερεύνηση της παρουσίας του βακτηρίου Alicyclobacillus σε χυμούς φρούτων, η απομόνωση των αποικιών, η ταυτοποίηση τους με RFLP PCR και ο έλεγχος της δυνατότητας τους να παράγουν γουαϊακόλη. Επίσης μελετήθηκε η επίδραση της υπερυψηλής υδροστατικής πίεσης στην αδρανοποίηση των σπορίων και των βλαστικών κυττάρων του βακτηρίου Alicyclobacillus acidoterrestris σε εμπορικό δείγμα χυμού πορτοκαλιού και ροδάκινου αμέσως μετά την επεξεργασία και κατά τη διάρκεια της συντήρησης σε διαφορετικές θερμοκρασίες. Αρχικά, πραγματοποιήθηκε έλεγχος σε εμπορικά δείγματα χυμών πορτοκαλιού και ροδάκινου από την ελληνική αγορά (Κεφάλαιο 2). Για το σκοπό αυτό, χυμοί ψυγείου και ραφιού από πορτοκάλι και ροδάκινο αναλύθηκαν φυσικοχημικά και μικροβιολογικά. Ο μικροβιολογικός έλεγχος είχε ως σκοπό την απαρίθμηση της ολικής αερόβιας μικροβιακής χλωρίδας, του πληθυσμού των οξυγαλακτικών βακτηρίων, των ζυμών και μυκήτων καθώς VI επίσης και του βακτηρίου Alicyclobacillus spp., ενώ ο φυσικοχημικός έλεγχος περιλάμβανε την μέτρηση της τιμής του pH και τη συγκέντρωση των ολικών διαλυτών στερεών. Τα αποτελέσματα έδειξαν χαμηλούς πληθυσμούς από τους εξεταζόμενους μικροοργανισμούς, αλλά επιβεβαίωσαν την παρουσία του βακτηρίου Alicyclobacillus spp. στους χυμούς. Στο Κεφάλαιο 3, απομονώσεις του βακτηρίου Alicyclobacillus spp. από χυμό πορτοκάλι που επιβεβαιώθηκαν σύμφωνα με τη μέθοδο IFU που αναπτύχθηκε από την Ομάδα Εργασίας για την Μικροβιολογία της Διεθνούς Ομοσπονδίας Παραγωγών Χυμών Φρούτων, αναλύθηκαν με την χρήση της μοριακής τεχνικής 16S rDNA PCR RFLP με 3 ένζυμα περιορισμού (HhaI, RSa I and HiNFI), για ταχεία ταυτοποίηση. Επιπροσθέτως, όλες οι απομονώσεις του βακτηρίου Alicyclobacillus ελέγχθηκαν για τη δυνατότητα παραγωγής γουαϊακόλης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η τεχνική PCR RFLP ομαδοποίησε τις απομονώσεις σε 8 ομάδες, εκ των οποίων 7 ήταν διαφορετικές από το χρησιμοποιούμενο στέλεχος αναφοράς. Επίσης, όλες οι απομονώσεις είχαν τη δυνατότητα παραγωγής γουαϊακόλης. Για την ταυτοποίηση των απομόνωσεων σε επίπεδο είδους χρησιμοποιήθηκε μονοενζυματική PCR RFLP. Για τον σκοπό αυτό, 78 απομονώσεις Alicyclobacillus υποβλήθηκαν σε ανάλυση PCR RFLP με τη χρήση εκκινητών για την ενίσχυση της V1-V3 μεταβλητής περιοχής του 16S rDNA γονιδίου και του περιοριστικού ενζύμου HhaI. Με την εφαρμογή της τεχνικής PCR RFLP οι απομονώσεις των A. acidoterrestris διαφοροποιήθηκαν επιτυχώς από εκείνες των A. acidocaldarius και A. hesperidum. Η παρουσία του βακτηρίου A. acidoterrestris στους χυμούς φρούτων μπορεί να επιφέρει σοβαρά προβλήματα αλλοίωσης. Για τον λόγο αυτό, διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητα της Υπερυψηλής Υδροστατικής Πίεσης στην αδρανοποίηση των σπορίων του βακτηρίου A. acidoterrestris (Κεφάλαιο 4). Συγκεκριμένα, σπόρια από δύο στελέχη του εν λόγω βακτηρίου (ένα άγριο στέλεχος απομονωμένο από χυμό μήλου και ένα στέλεχος αναφοράς) εμβολιάστηκαν σε χυμό πορτοκάλι και υποβλήθηκαν σε υπερυψηλή υδροστατική πίεση σε 500 και 600 MPa σε συνδυασμό με ταυτόχρονη θέρμανση σε διαφορετικές θερμοκρασίες (25, 45, 60, and 70 °C) και διάρκεια έως 30 min (1, 3, 5, 15 και 30 min). Στη συνέχεια το πρωτογενές μοντέλο Weibull προσαρμόστηκε στα πειραματικά δεδομένα της αδρανοποίησης των δύο στελεχών. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η αδρανοποίηση των σπορίων αυξάνονταν με την αύξηση των επιπέδων πίεσης και θερμοκρασίας. Πλήρης αδρανοποίηση των σπορίων και για τα δύο στελέχη επιτεύχθηκε στην υψηλότερη πίεση (600 MPa) και την υψηλότερη θερμοκρασία (70 °C). Επίσης παρατηρήθηκε ότι το μοντέλο VII Weibull μπόρεσε να περιγράψει ικανοποιητικά την αδρανοποίηση των σπορίων του βακτηρίου A. acidoterrestris για τα διαφορετικά επίπεδα πίεσης και θερμοκρασίας. Παρότι η αδρανοποίηση του βακτηρίου A. acidoterrestris έχει μελετηθεί εκτενώς, η επιβίωση των σπορίων και των βλαστικών μορφών του μικροοργανισμού κατά τη διάρκεια της συντήρησης των χυμών φρούτων μετά την επεξεργασία με ΥΥΠ, δεν έχει τεκμηριωθεί επαρκώς. Για τον σκοπό αυτό, στο Κεφάλαιο 5 δείγματα πορτοκαλοχυμού εμβολιάστηκαν με τα σπόρια δύο στελεχών του βακτηρίου A. acidoterrestris -που χρησιμοποιήθηκαν και στην μελέτη του Κεφαλαίου 4- και υποβλήθηκαν σε ΥΥΠ σε 600 MPa/60 °C για 5 και 10 min αντίστοιχα. Τόσο τα επεξεργασμένα όσο και τα μη επεξεργασμένα δείγματα (μάρτυρας) συντηρήθηκαν σε θερμοκρασίες 4, 12 και 25 °C για 60 ημέρες. Στα δείγματα πραγματοποιούνταν μικροβιολογικές αναλύσεις κάθε εβδομάδα ώστε να καταγραφεί η μεταβολή του πληθυσμού των σπορίων και των βλαστικών κυττάρων κατά τη διάρκεια της συντήρησης. Τα αποτελέσματα έδειξαν μείωση της εκβλάστησης των σπορίων που επιβίωσαν από την επεξεργασία, το μέγεθος της οποίας καθορίστηκε από το στέλεχος του βακτηρίου, την πίεση, τον χρόνο επεξεργασίας και την θερμοκρασία συντήρησης, ενώ τα εναπομείναντα βλαστικά κύτταρα δεν ανιχνεύθηκαν κατά την συντήρηση του χυμού σε χαμηλές θερμοκρασίες. Επίσης, με σκοπό την μελέτη της δυναμικής των σπορίων και των βλαστικών κυττάρων κατά την συντήρηση των χυμών σε υψηλότερες θερμοκρασίες, σπόρια του στελέχους αναφοράς A. acidoterrestris ATCC 49025 εμβολιάστηκαν σε δείγματα χυμού ροδάκινου. Τα δείγματα υποβλήθηκαν σε ΥΥΠ σε 500 και 600 MPa σε συνδυασμό με ταυτόχρονη θέρμανση (25, 45 και 60 °C) για 10 min. Επεξεργασμένα και μη επεξεργασμένα (μάρτυρας) δείγματα χυμού ροδάκινου συντηρήθηκαν σε θερμοκρασίες 25, 35 και 45 °C και αναλύθηκαν μικροβιολογικά για χρονικό διάστημα έως 240 h. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η επεξεργασία με ΥΥΠ σε 600 MPa/60 °C/10 min μπόρεσε να εξουδετερώσει τα σπόρια του βακτηρίου κατά την συντήρηση του χυμού σε θερμοκρασία 25 °C, ενώ o πληθυσμός των βλαστικών κυττάρων μπόρεσε να εξαλειφθεί με την ίδια επεξεργασία σε όλες τις εξεταζόμενες θερμοκρασίες συντήρησης του χυμού.