Biorefinery and bioprocess development for the production of bio-based succinic acid, protein isolate and bacterial nanocellulose – The case of biodegradable film production for food packaging applications

Abstract

This PhD dissertation focuses on the valorisation of renewable resources derived from the biodiesel and confectionery industries (i.e. sunflower meal (SFM), crude glycerol and confectionery waste streams) for the production of high value-added end-products (antioxidant and protein rich extracts, succinic acid, bacterial cellulose, bacterial cellulose nanostructures and protein-based composite biofilms) employing circular oriented practices. In this framework, a novel bio-economy business model for production of bio-based succinic acid and value-added co-products has been developed using biodiesel industry by-products. Antioxidant and protein rich extracts were obtained as added-value value co-products through SFM fractionation. Solid state fermentation (SSF) by Aspergillus awamori using untreated SFM resulted in the production of crude enzyme complexes (cellulase, β-glucosidase, xylanase, protease and phytase). After the extraction of co-products, the residual SFM was hydrolysed via thermochemical and enzymatic treatment using crude enzymes resulting in conversion yields of 0.35 g/g total Kjeldahl nitrogen to free amino nitrogen, 0.56 g/g cellulose to glucose and 0.92 g/g hemicellulose to sugars. The SFM-derived hydrolysate was used in fed-batch cultures of Actinobacillus succinogenes leading to 34 g/L succinic acid with a yield of 0.6 g/g and a productivity of 0.71 g/L/h. Crude glycerol supplemented with SFM hydrolysate resulted in 69.1 g/L succinic acid with a yield of 0.39 g/g and a productivity of 1.26 g/L/h by Yarrowia lipolytica PSA02004. SFM was efficiently used for co-product extraction, fermentation medium production and on-site crude enzyme production via SSF. Bacterial cellulose (BC) was produced using crude confectionery waste hydrolysates derived after enzymatic hydrolysis employing crude enzyme consortia via fungal SSF. The highest BC concentration (5.7 g/L) was achieved by Komagataeibacter sucrofermentans cultivated in static cultures at carbon to free amino nitrogen ratio of 24.5 g/g and pH 5. BC was treated with H2SO4, HCl and combined H2SO4-HCl at varying hydrolysis time to produce BC nanostructures (BCNs) of diverse properties. The FTIR spectra of all BCNs demonstrated typical cellulose vibration bands, while the peaks at 709 cm-1 and 746 cm-1 indicated the presence of Iα and Ιβ allomorphs. Dynamic light scattering (DLS) analysis showed polydispersity, while lower hydrodynamic radiuses (Rh) of 56 nm and 385 nm were observed in the case of H2SO4-assisted hydrolysis after 48 h. The crystallinity index (CrI) of BC (77.9%) was lower than that of BCNs while hydrolysis up to 24 h lead to CrIs of 90.9% for H2SO4, 98.4% for HCl and 98.1% for combined H2SO4-HCl. The ζ-potential values of BCNs reached up to -34.3 mV, -12.3 mV and -28.7 mV after 48 h hydrolysis using H2SO4, HCl and H2SO4-HCl, respectively. SEM micrographs showed rodlike-shaped nanocrystals with a strong tendency towards aggregation and overlapping. Overall, ex-situ modification of BC through acid hydrolysis led to effective production of nanostructures with distinctive properties and potential applications as packaging materials. The production of bio-based and biodegradable food packaging composite materials was also evaluated. BC was produced via fermentation in static tray bioreactors utilising sunflower-based biodiesel industry by-product streams (nutrient-rich supplements derived from the enzymatic hydrolysis of SFM combined and crude glycerol) as carbon and nutrient sources. Novel biofilms were produced using either matrices of protein isolates extracted from SFM (SFMPI) alone or SFMPI matrices reinforced with nanocellulose biofillers of commercial or bacterial origin. Acid hydrolysis was employed for ex-situ modification of BC to nanostructures. The biofilms reinforced with bacterial nanocellulose structures (SFMPI-BNC) showed 64.5% higher tensile strength, 75.5% higher Young’s modulus, 131.5% higher elongation at break, 32.5% lower water solubility and 14.1% lower water vapor permeability than the biofilms produced only with SFMPI. The biofilms were evaluated on fresh strawberries packaging showing that the SFMPI-BNC-based films lead to effective preservation at 10°C considering microbial growth and physicochemical profile (weight loss, chemical characterization, color, firmness and respiration activity). The SFMPI-BNC-based films could be applied in fresh fruit packaging applications.

Η παρούσα διδακτορική διατριβή επικεντρώνεται στην αξιοποίηση ανανεώσιμων πρώτων υλών που προέρχονται από τη βιομηχανία του βιοντίζελ και της ζαχαροπλαστικής (ηλιάλευρα (SFM), ακατέργαστη γλυκερόλη και ροές αποβλήτων της βιομηχανίας ζαχαροπλαστικής) για την παραγωγή τελικών προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας (εκχυλίσματα πλούσια σε αντιοξειδωτικά και πρωτεΐνες, ηλεκτρικό οξύ, βακτηριακή κυτταρίνη, νανοδομές βακτηριακής κυτταρίνης και σύνθετα βιοφιλμ με βάση τις πρωτεΐνες) εφαρμόζοντας πρακτικές που διευκολύνουν τη μετάβαση στη νέα εποχή της βιο-οικονομίας. Σε αυτά τα πλαίσια, αναπτύχθηκε ένα νέο επιχειρηματικό μοντέλο βιοοικονομίας για την παραγωγή βιογενούς ηλεκτρικού οξέος και συμπροϊόντων προστιθέμενης αξίας, χρησιμοποιώντας υποπροϊόντα της βιομηχανίας βιοντίζελ. Εκχυλίσματα πλούσια σε αντιοξειδωτικά και πρωτεΐνες ελήφθησαν ως συμπροϊόντα προστιθέμενης αξίας μέσω της κλασματοποίησης του SFM. Η παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων (κυτταρινάσες, β-γλυκοσιδάση, ξυλανάσες, πρωτεάσες και φυτάσες) πραγματοποιήθηκε μέσω ζυμώσεων στερεής κατάστασης (SSF) από τον μικροοργανισμό Aspergillus awamori χρησιμοποιώντας μη επεξεργασμένο SFM. Μετά την παραλαβή των αντιοξειδωτικών και των πρωτεϊνικών κλασμάτων, το υπολειπόμενο SFM υδρολύθηκε μέσω χημικής και ενζυμικής επεξεργασίας με εφαρμογή των ακατέργαστων ενζύμων που παρήχθησαν. Η μέγιστη απόδοση μετατροπής ολικού αζώτου (Kjeldahl) προς άζωτο που περιέχεται στις ελεύθερες αμινομάδες αμινοξέων και πεπτιδίων (free amino nitrogen-FAN) προσδιορίστηκε ίση με 0,35 g/g, ενώ οι αντίστοιχες αποδόσεις μετατροπής κυτταρίνης και ημικυτταρίνης βρέθηκαν ίσες με 0,56 g/g και 0,92 g/g. αντίστοιχα. Τα ακατέργαστα προϊόντα της υδρόλυσης του SFM χρησιμοποιήθηκαν κατά την καλλιέργεια ημισυνεχούς τροφοδοσίας του μικροοργανισμού Actinobacillus succinogenes και οδήγησαν στην παραγωγή 34 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση μετατροπής 0,6 g/g και παραγωγικότητα 0,71 g/L/h. Η αξιοποίηση ακατέργαστης γλυκερόλης εμπλουτισμένης με υδρόλυμα SFM είχε ως αποτέλεσμα την παραγωγή 69,1 g/L ηλεκτρικού οξέος με απόδοση μετατροπής 0,39 g/g και παραγωγικότητα 1,26 g/L/h από την τροποποιημένη ζύμη Yarrowia lipolytica PSA02004. Σε αυτό το στάδιο της μελέτης το SFM που προκύπτει ως παραπροϊόν από τη διαδικασία παραγωγής βιοντίζελ χρησιμοποιήθηκε αποτελεσματικά για την εκχύλιση συμπροϊόντων (αντιοξειδωτικά και πρωτεϊνικά κλάσματα), την παραγωγή θρεπτικού μέσου ζύμωσης καθώς και την επιτόπια παραγωγή ακατέργαστων ενζύμων. Για την παραγωγή της βακτηριακής κυτταρίνη (BC) ως θρεπτικό μέσω ζύμωσης χρησιμοποιήθηκαν ακατέργαστα προϊόντα ενζυμικής υδρόλυσης των απόβλητων της βιομηχανίας ζαχαροπλαστικής, τα οποία παρήχθησαν με χρήση ακατέργαστων ενζύμων που προέκυψαν μετά από SSF με το μυκητιακό στέλεχος A. awamori. Η υψηλότερη συγκέντρωση BC (5,7 g/L) επιτεύχθηκε από τον μικροοργανισμό Komagataeibacter sucrofermentans κατά την καλλιέργεια του υπό στατικές συνθήκες, σε αναλογία άνθρακα προς άζωτο ελεύθερων αμινομάδων 24,5 g/g και pH 5. Η BC υποβλήθηκε σε κατεργασία με H2SO4, HCl και μίγμα αυτών σε διαφορετικούς χρόνους επεξεργασίας με σκοπό την παραγωγή νανοδομών BC (BCNs) διαφορετικών ιδιοτήτων. Τα φάσματα FTIR όλων των BCN που παρήχθησαν, παρουσίασαν τυπικές ζώνες δόνησης κυτταρίνης, ενώ οι κορυφές στα 709 cm-1 και 746 cm-1 έδειξαν την παρουσία αλλόμορφων Ια και Ιβ. Η ανάλυση δυναμικής σκέδασης φωτός (DLS) υπέδειξε ότι τα εναιωρήματα των παραγόμενων ΒCN χαρακτηρίζονται από πολυδιασπορά, ενώ χαμηλότερες υδροδυναμικές ακτίνες (Rh) 56 nm και 385 nm παρατηρήθηκαν στην περίπτωση της υδρόλυσης με χρήση H2SO4 μετά από 48 ώρες επεξεργασίας. Ο δείκτης κρυσταλλικότητας (CrI) της BC (77,9%) ήταν χαμηλότερος από αυτόν των BCN, ενώ η υδρόλυση έως και 24 ώρες είχε σαν αποτέλεσμα CrI 90,9%, 98,4% και 98,1% κατά την εφαρμογή H2SO4, HCl και του μίγματος αυτών αντίστοιχα. Οι τιμές του ζ-δυναμικού των BCN μετά από 48 ώρες κατεργασίας έφθασαν έως -34,3 mV με χρήση H2SO4, -12,3 mV με χρήση HCl και -28,7 mV με εφαρμογή του μίγματος των δύο οξέων. Μορφολογικά, μετά από ανάλυση με χρήση ηλεκτρονικού μικροσκοπίου σάρωσης (SEM), οι BCN παρουσίασαν νανοκρυσταλλική δομή σε σχήμα ράβδου με έντονη τάση συσσωμάτωσης και επικάλυψης. Συμπερασματικά, η ex-situ τροποποίηση της BC μέσω όξινης υδρόλυσης οδήγησε στην αποτελεσματική παραγωγή νανοδομών με διακριτικές ιδιότητες και πιθανές εφαρμογές ως υλικά συσκευασίας. Σε επόμενο στάδιο της μελέτης, αξιολογήθηκε η παραγωγή βιοαποικοδομήσιμων συσκευασιών τροφίμων με βάση τις αρχές της κυκλικής οικονομίας. Η BC παρήχθη μέσω ζύμωσης σε βιοαντιδραστήρες στατικού τύπου, χρησιμοποιώντας ροές παραπροϊόντων της βιομηχανίας βιοντίζελ με βάση τον ηλίανθο (ενζυμικά υδρολύματα από SFM και ακατέργαστη γλυκερόλη) ως πηγές άνθρακα και θρεπτικών συστατικών. Δημιουργήθηκαν καινοτόμα βιοφιλμ, χρησιμοποιώντας είτε απομονωμένες πρωτεΐνες από SFM (SFMPI) αποκλειστικά, είτε με χρήση SFMPI που ενισχύθηκαν με βιοπληρωτικά νανοκυτταρίνης εμπορικής ή βακτηριακής προέλευσης. Η ex-situ τροποποίηση της BC σε νανοδομές πραγματοποιήθηκε με εφαρμογή όξινης υδρόλυσης. Τα βιοφιλμ που ενισχύθηκαν με δομές βακτηριακής νανοκυτταρίνης (SFMPI-BNC) παρουσίασαν 64,5% υψηλότερη αντοχή στον εφελκυσμό, 75,5% υψηλότερο μέτρο Young’s, 131,5% μεγαλύτερη επιμήκυνση στη θραύση, 32,5% χαμηλότερη διαλυτότητα στο νερό και 14,1% χαμηλότερη ικανότητα διαπερατότητας σε υδρατμούς συγκριτικά με τα μη ενισχυμένα βιοφιλμ (SFMPI). Τα βιοφίλμ αξιολογήθηκαν σε συσκευασία φρέσκων φρούτων (φράουλες). Λαμβάνοντας υπόψη τη μικροβιακή ανάπτυξη και το φυσικοχημικό προφίλ των συσκευασμένων φρούτων (απώλεια βάρους, χημικός χαρακτηρισμός, χρώμα, υφή και αναπνευστική δραστηριότητα), τα ενισχυμένα βιοφιλμ SFMPI-BNC παρουσίασαν ικανοποιητικά αποτελέσματα κατά την ισοθερμική συντήρηση στους 10°C. Συνεπώς τα βιοφιλμ SFMPI-BNC που παρήχθησαν θα μπορούσαν να εφαρμοστούν σε εφαρμογές συσκευασίας φρέσκων φρούτων.