Ενζυμική μηχανική και ανάπτυξη βιοτεχνολογικών εφαρμογών σε διαγνωστικά και θεραπευτικά ένζυμα

Abstract

Τα ένζυμα αξιοποιούνται σε ευρύ φάσμα βιοτεχνολογικών, βιομηχανικών, βιοϊατρικών και φαρμακευτικών εφαρμογών. Η ταχύρυθμη πρόοδος της μοριακής βιολογίας και βιοτεχνολογίας κατά τις τελευταίες δεκαετίες έχει καταστήσει εφικτή τη τροποποίηση και τη βελτιστοποίηση υφιστάμενων ενζύμων μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής, αλλά και τον ορθολογικό σχεδιασμό νεοσύστατων βιοκαταλυτών με εξειδικευμένες λειτουργίες. Στόχος της διατριβής ήταν ο σχεδιασμός και η ανάπτυξη καινοτόμων βιοκαταλυτών με βελτιωμένα χαρακτηριστικά, οι οποίοι δύναται να χρησιμοποιηθούν σε εύρος βιοτεχνολογικών εφαρμογών. Οι τροποποιημένοι βιοκαταλύτες αναπτύχθηκαν αξιοποιώντας πολύπλευρες διεπιστημονικές προσεγγίσεις με εργαλεία της ενζυμικής μηχανικής, της αναλυτικής χημείας, της δομικής βιολογίας/βιοϋπολογιστικής και της βιονανοτεχνολογίας. Ο πρώτος και κύριος πυλώνας της διατριβής εστίασε στην τροποποίηση των πολυλειτουργικών ενζύμων αποτοξίνωσης, τρανσφεράσες της γλουταθειόνης (GSTs), οι οποίες έχουν χρησιμοποιηθεί σε διαγνωστικές και θεραπευτικές εφαρμογές. Οι GSTs αποτελούν ένζυμα της Φάσης ΙΙ της κυτταρικής αποτοξίνωσης και καταλύουν τη σύζευξη του τριπεπτιδίου της γλουταθειόνης με ενδογενείς ή εξωγενείς ηλεκτρονιόφιλες υδρόφοβες ενώσεις, για τον σχηματισμό πιο υδατοδιαλυτών συμπλόκων που απομακρύνονται ευκολότερα από το κύτταρο. Εντοπίζονται στους περισσότερους οργανισμούς και έχουν συνδεθεί με την εμφάνιση φαινομένων μειωμένης αποτελεσματικότητας φαρμάκων στον άνθρωπο αλλά και αντοχής σε ζιζανιοκτόνα σε φυτικούς οργανισμούς. Η εκτεταμένη εφαρμογή ζιζανιοκτόνων για το μεταφυτρωτικό έλεγχο καλλιεργειών έχει συνδράμει στην εμφάνιση πληθυσμών ζιζανίων που εμφανίζουν αντοχή σε ζιζανιοκτόνα με διαφορετικούς τρόπους δράσης και περιορισμένες ομοιότητες στη χημική δομή (Μultiple Ηerbicide Resistance: MHR). Το φαινόμενο MHR σχετίζεται με τον ενισχυμένο μεταβολισμό και την ικανότητα αποτοξίνωσης των ενδογενών ενζύμων των ζιζανίων, όπως και οι GSTs της phi κλάσης (GSTFs) στα Alopecurus myosuroides και Lolium rigidum. Τα ένζυμα αυτά αποτρέπουν το ζιζανιοκτόνο να φθάσει στη θέση-στόχο, χωρίς να δρουν απευθείας σε αυτή. Στην παρούσα εργασία τροποποιήθηκαν επιλεγμένες GSTFs μέσω πρωτεϊνικής μηχανικής, με σκοπό την μελέτη της εξέλιξης των μηχανισμών του MHR, αλλά και την βελτίωση των καταλυτικών και δομικών τους ιδιοτήτων. Μέσω in vitro κατευθυνόμενης εξέλιξης (DNA shuffling), αναπτύχθηκε μια βιβλιοθήκη GSTF μορφών μέσω ανασυνδυασμού τμημάτων επιλεγμένων gstf γονιδίων με υψηλή ομολογία, τα οποία προέρχονταν από τα MHR ζιζάνια Alopecurus myosuroides και Lolium rigidum και τα καλλιεργούμενα σιτηρά Triticum durum και Hordeum vulgare. Οι GSTFs των σιτηρών εμφάνιζαν σημαντικά υψηλότερες καταλυτικές σταθερές συγκριτικά με εκείνες των ζιζανίων, συνεπώς οι επιλεγμένες ενζυμικές μορφές αποτέλεσαν ιδανικό μοντέλο για τη συσχέτιση της δομής και λειτουργίας μέσω μεθόδων κατευθυνόμενης εξέλιξης. Κατά το DNA shuffling, τα gstf γονίδια άγριου τύπου υποβλήθηκαν σε πέψη με DNAse και τα τμήματα που προέκυψαν επανενώθηκαν μέσω PCR χωρίς προσθήκη εξωγενών εκκινητών, σχηματίζοντας τελικά χιμαιρικές ενζυμικές μορφές. Στη συνέχεια, πραγματοποιήθηκε σάρωση αποικιών ως προς την ενζυμική δραστικότητα για τη σύσταση βιβλιοθήκης χιμαιρικών ενζύμων. Οι ενζυμικές παραλλαγές με την υψηλότερη ειδική δραστικότητα καθαρίστηκαν με μεταλλοχηλική χρωματογραφία και χαρακτηρίστηκαν ως προς τα κινητικά τους χαρακτηριστικά, τη θερμοσταθερότητα και την δυνατότητα αναστολής της δράσης τους με παρουσία χλωρακεταμιδικών ζιζανιοκτόνων, για τα οποία εμφάνιζαν εκλεκτικότητα τα ένζυμα αγρίου τύπου. Η μελέτη ανέδειξε την ενζυμική μορφή sh101 με επταπλάσια βελτίωση στην καταλυτική σταθερά και βελτιωμένη θερμική σταθερότητα κατά 8,3 ℃, και την sh155 με τρεις φορές υψηλότερη ευαισθησία αναστολής προς το ζιζανιοκτόνο butachlor. Επιπροσθέτως, η επίλυση των κρυσταλλικών δομών μέσω ακτίνων Χ των παραλλαγών sh101 και sh155 του DNA shuffling επέτρεψε τον εντοπισμό δομικών στοιχείων που εμπλέκονται στη ρύθμιση της kcat, στη θερμική σταθερότητα και την ανασταλτική ισχύ. Η αυτοσυναρμολόγηση πρωτεϊνών (protein self-assembly) έχει χρησιμοποιηθεί για την ανάπτυξη δομικά σταθερών, βιοσυμβατών και βιοαποδομήσιμων νανοϋλικών, εμπνευσμένων από φυσικές πρωτεϊνικές δομές οι οποίες ενέχουν δομικό, καταλυτικό ή σηματοδοτικό ρόλο. Με στόχο την αυτοσυναρμολόγηση λειτουργικών και σταθερών ενζυμικών νανοσυμπλόκων, επιλέχθηκε προς τροποποίηση η ενζυμική παραλλαγή sh101 με τα βέλτιστα κινητικά χαρακτηριστικά, και η sh155 η οποία, εκτός από βελτιωμένες κινητικές παραμέτρους, παρουσίαζε υψηλή εξειδίκευση και ευαισθησία για το ζιζανιοκτόνο butachlor. Το sh155, λόγω της σταθερότητας που αναμένεται να αποκτήσει κατά την αυτοσυναρμολόγηση, αποτελεί ιδιαίτερα υποσχόμενο μέσο για την ανάπτυξη ενός ενζυμικού βιοαισθητήρα προσδιορισμού του butachlor σε δείγματα νερού. Στο εγχείρημα της αυτοσυναρμολόγησης GSTF νανοσυμπλεγμάτων χρησιμοποιήθηκε μια μακροκυκλική ένωση (ξενιστής) ως εκλεκτική “κόλλα” μεταξύ των ενζυμικών μορίων μετά από προσθήκη κατάλληλου αμινοξικού επιτόπου στο Ν-τελικό τους άκρο. Ο επίτοπος που επιλέχθηκε παρουσιάζει εκλεκτικότητα και υψηλή συγγένεια δέσμευσης με το μόριο-ξενιστή. Συνεπώς, μέσω αλληλεπιδράσεων ξενιστή-ξενιζομένου (host-guest) υλοποιήθηκε η σύνθεση GSTF νανοσυμπλόκων. Αρχικά, οι επισημασμένες με ισοθειοκυανική φλουορεσκεΐνη GSTFs εμφάνισαν μείωση στην ένταση φθορισμού τους, μετά την προσθήκη του ξενιστή σε διαφορετικές στοιχειομετρικές αναλογίες, η οποία συνδέθηκε με την καθίζηση πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων και τον ολιγομερισμό των GSTF μορίων. Η παρατήρηση των επισημασμένων GSTFs, μέσω συνεστιακής μικροσκοπίας (CLSM), ανέδειξε το σχηματισμό πρωτεϊνικών συσσωματωμάτων στη μικροκλίμακα. Επιπλέον, η μορφολογία των δειγμάτων μελετήθηκε περαιτέρω στην νανοκλίμακα με ηλεκτρονική μικροσκοπία σάρωσης (SEM). Η ανάλυση των δειγμάτων με HPLC μοριακού ηθμού, σε συνδυασμό με την επίλυση μιας κρυσταλλικής δομής των πρωτεϊνικών νανοσυμπλόκων, αποκάλυψαν ότι ευνοείται ο σχηματισμός καθορισμένων ολιγομερών συμπλεγμάτων στις υπό μελέτη συνθήκες. Τα ενζυμικά νανοσυμπλέγματα που χαρακτηρίστηκαν διατηρούσαν τις καταλυτικές τους ιδιότητες. Η παραπάνω μελέτη συνέβαλε στην ανάπτυξη μεθόδων ορθολογικού σχεδιασμού μέσω αλληλεπιδράσεων ξενιστή-ξενιζομένου για την αυτοσυναρμολόγηση καινοτόμων GSTF νανοδομών με βελτιωμένες ιδιότητες για βιοτεχνολογικές και βιοϊατρικές εφαρμογές. Το πεδίο των ενζυμικών βιοαισθητήρων έχει αναπτυχθεί εκτενώς τις τελευταίες δεκαετίες, αποδίδοντας οικονομικές και εύχρηστες μεθόδους για ποιοτική και ποσοτική ανάλυση μεγάλου εύρους ενώσεων-στόχων, με εφαρμογή στη βιοϊατρική, στην ανίχνευση περιβαλλοντικών ρύπων, στην ασφάλεια τροφίμων και στον έλεγχο βιομηχανικών διεργασιών. Η εντατικοποίηση χρήσης φυτοφαρμάκων στις γεωργικές πρακτικές οδηγεί στη μόλυνση των υδάτινων πεδίων από γεωργικά υπολείμματα. Ένα εγχείρημα της διατριβής ήταν η ανάπτυξη ενός ενζυμικού βιοαισθητήρα για τον προσδιορισμό του χλωρακεταμιδικού ζιζανιοκτόνου butachlor σε δείγματα νερού. Στη μέθοδο αξιοποιήθηκε το εξαιρετικά σταθερό νανοσύμπλεγμα της ενζυμικής μορφής sh155, η οποία εμφάνιζε εκλεκτικότητα και ευαισθησία για το butachlor. Η ακινητοποίηση του GSTF νανοσυμπλέγματος πραγματοποιήθηκε μέσω ομοιοπολικής σύνδεσης σε κατάλληλο φορέα μετά από αντίδραση με γλουταραλδεΰδη. Ο συνδυασμός της τεχνολογίας ακινητοποίησης σε κατάλληλο πολυμερές υλικό με την υπερμοριακή GSTF δομή απέδωσε στο σύστημα εξαιρετική σταθερότητα. Η μέθοδος που αναπτύχθηκε για τον προσδιορισμό του butachlor σε δείγματα νερού βασίστηκε στην αναστολή της δράσης των GSTFs και αποτελεί μια χαμηλού κόστους επιλογή για σάρωση μεγάλου όγκου δειγμάτων έναντι των συμβατικών αναλυτικών χρωματογραφικών τεχνικών, με επαρκή ευαισθησία για την ανίχνευση συγκεντρώσεων butachlor έως 0,18 μg/mL. Στο δεύτερο μέρος της διατριβής μελετήθηκε η πρωτεολυτική ικανότητα του Arthrospira platensis (κοινή σπιρουλίνα), με σκοπό την ανάπτυξη ενός ενζυμικού σκευάσματος με πρωτεολυτική δράση και πιθανή δερματική χρήση. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα αποτελούν τα πιο ευρέως χρησιμοποιούμενα ένζυμα βιομηχανικής κλίμακας, ενώ διαθέτουν ποικίλες εφαρμογές στην ιατρική και στη κοσμητολογία. Η μελέτη επικεντρώθηκε στην επίδραση του pH και της παρουσίας δισθενών ιόντων μέταλλων στην πρωτεολυτική δράση σε διαφορετικά υποστρώματα. Τα πρωτεολυτικά ένζυμα του εκχυλίσματος αξιολογήθηκαν μέσω ζυμογραφίας, η οποία υπέδειξε την ύπαρξή τουλάχιστον δυο διαφορετικών πρωτεολυτικών ενζύμων. Ακόμα, αναπτύχθηκε ήπια μέθοδος διαχωρισμού των συστατικών του εκχυλίσματος, με ικανοποιητική καθαρότητα και απόδοση, μέσω υδατικού διφασικού συστήματος (ATPS). Τελικά, το εκχύλισμα του A. platensis χρησιμοποιήθηκε για την ανάπτυξη ενός σκευάσματος υδρογέλης, όπου η πρωτεολυτική του δράση μπορεί να συμβάλει στην τοπική βελτίωση της επιδερμικής επιφάνειας ως απολεπιστικός παράγοντας. Οι θαλάσσιοι πόροι θεωρούνται ασφαλείς, με αμελητέα κυτταροτοξικότητα για τον άνθρωπο, ενώ είναι πλούσιοι σε βιοδραστικές ουσίες με οφέλη για το δέρμα. Το σκεύασμα υδρογέλης που κατασκευάστηκε έδρασε ως μέσο εγκλωβισμού των πρωτεολυτικών ενζύμων του κυανοβακτηρίου, βελτιώνοντας σημαντικά την σταθερότητά τους στο χρόνο, γεγονός που αποτελεί πλεονέκτημα στην ανάπτυξη προϊόντων με ενζυμική δράση.

The extensive utilization of enzymes in biotechnological, industrial, biomedical, and pharmaceutical applications is indisputable. The extensive progress of molecular biology and biotechnology in the last decades has enabled the modification and optimization of native enzymes via protein engineering, as well as rational design of novel specialized biocatalysts with purposed-made functionality. The aim of the present thesis was the design and development of innovative biocatalysts with improved properties that may be used in a range of biotechnological applications. The modified biocatalysts were developed utilizing multidisciplinary approaches, based on enzyme engineering, analytical chemistry, structural biology/bioinformatics and bionanotechnology. The first and main research interest of the thesis was the modification of selected glutathione transferases (GSTs), which are multifunctional detoxification enzymes with significant diagnostic and therapeutic applications. GSTs are enzymes of the phase II of cell detoxification mechanism and catalyze the conjugation of the tripeptide glutathione (GSH) with electrophilic and hydrophobic compounds, thus forming more water-soluble products that are easily excreted from the cells. GSTs are found in most organisms and have been linked to the phenomenon of drug and pesticide resistance. The extensive application of herbicides has contributed to the emergence of weed populations that exhibit resistance to multiple herbicides with different modes of action and limited similarities in their chemical structure (Multiple Herbicide Resistance: MHR). The MHR phenomenon is related to the enhanced metabolism and detoxification capacity of endogenous enzymes in weeds, such as phi class GSTs (GSTFs) of Alopecurus myosuroides and Lolium rigidum. These enzymes prevent the herbicide from reaching the target site, without acting directly on it. In the present work, selected GSTFs were engineered in order to investigate the evolution of MHR mechanisms, as well as to construct of enzyme variants with improved catalytic properties. A library of GSTFs was constructed by in vitro directed evolution (DNA shuffling), after recombination of gstf genes with high homology that were found in the weeds Alopecurus myosuroides and Lolium rigidum, and the cereal crops Triticum durum and Hordeum vulgare. The GSTFs of cereal crops exhibited significantly higher catalytic constants, therefore the selected enzyme forms were ideal for the correlation of structure and function of GSTFs via directed evolution methods. DNA shuffling entailed the digestion of the wild-type gstf genes with DNAse, and the resulting DNA fragments were reassembled by PCR without the addition of external primers for the formation of chimeric enzyme forms. The library was activity screened and the best-performing enzyme variants were purified and their kinetic properties, thermostability and inhibition potency against chloroacetamide herbicides were investigated. The study revealed an enzyme variant (sh101) with a sevenfold improvement in its catalytic constant (kcat) and improved thermal stability by 8.3 ℃, as well as a variant (sh155) with three times higher inhibition potency towards the herbicide butachlor. Furthermore, the resolution of the 3D structures of sh101 and sh155 variants using x-ray crystallography allowed the identification of important structural elements involved in kcat regulation, thermal stability and inhibition potency. Protein self-assembly has been utilized for the development of structurally robust, biocompatible and biodegradable nanomaterials inspired by natural nanostructures with structural, catalytic, or signaling properties. The GSTF variants sh101 and sh155, which were derived by DNA shuffling, were selected for further modification in order to construct functional and stable self-assembled supramolecular nanocomplexes due to host-guest interactions. The sh101 variant showed the most improved kinetic parameters and thermal stability; in addition sh155 was selected due to its improved kinetic parameters and high specificity and sensitivity (low IC50 value) for the herbicide butachlor. The latter may be an ideal candidate for the development of an enzymatic biosensor for detection of butachlor in water samples, due to the stability it is expected to acquire by the nanocomplex formation. Protein self-assembly was accomplished using host-quest interaction chemistry, due to the properties of a macrocyclic host. The host was used as a selective “glue” for the GSTF molecules, after addition of an amino acid tag at their N-terminal site. The selected amino acid tag exhibits selectivity and high binding affinity towards the host. Initially, reduction of fluorescence intensity was detected in fluorescein isothiocyanate labeled GSTFs, after the addition of the host in different stoichiometric ratios. The reduction was associated with precipitation of protein aggregates as well as oligomerization of GSTF molecules. Confocal laser scanning microscopy (CLSM) of the labeled samples indicated the formation of protein aggregates in the microscale. The morphology of the self-assembled complexes was further examined by scanning electron microscopy (SEM) in the nanoscale. The SEC HPLC analysis combined with the resolution of the crystal structure of sh155 with the host, revealed the favored formation of defined GSTF nanocomplexes in the studied conditions. These nanocomplexes retained their catalytic properties. This work has contributed to the development of rational design methods for self-assembling of novel GSTF nanostructures with improved properties, that may be utilized in a range of biotechnological and biomedical applications. Enzyme biosensors have been extensively developed in the recent years, thus yielding cost-effective and easy-to-use methods for qualitative and quantitative analysis of a range of target molecules with extensive applications in biomedicine, pollutant detection, food safety and control of industrial processes. The growing nutritional needs have been linked to the intensification of pesticide use in agricultural practices, which results in the contamination of water with agricultural residues. Consequently, an objective of the present thesis was the development of an enzymatic biosensor for the detection of the herbicide butachlor in water samples. Therefore, the nano-complex of the enzyme form sh155, which exhibited selectivity and sensitivity towards butachlor, was immobilized on a suitable carrier. This supramolecular enzyme complex was formed due to non-covalent interactions into symmetrical oligomers, as well as nano- and microscale complexes of higher order. The combination of immobilization on a suitable polymer-carrier and the stability of the GSTF supramolecular structure, resulted in a highly efficient system. The developed detection methodology was based on the inhibition of GSTFs in the presence of butachlor and is a low-cost alternative to analytical chromatographic methods. Moreover, it entails sufficient sensitivity and repeatability in order to determine butachlor concentrations up to 0.18 µg/mL. In the second part of the thesis, the proteolytic activity of Arthrospira platensis (commonly referred to as spirulina), which was derived from a commercial food supplement, was determined. Marine resources are generally considered safe, with negligible cytotoxicity for humans, while they are rich in bioactive substances that are beneficial for the skin. Proteases are the most widely used industrial enzymes, and have diverse applications in medicine and cosmetology. The study was focused on the effects of pH and divalent metal ions on the proteolytic activity with different substrates. The proteolytic content of the lysate was evaluated by zymography. The results indicated the presence of at least two different proteolytic enzymes in A. platensis. Furthermore, a mild purification method was developed based on aqueous two-phase system (ATPS) with satisfactory yield and purity. Finally, the A. platensis lysate was used to develop a hydrogel formulation with potential dermal use, where its proteolytic activity may possibly contribute to the improvement of the epidermal surface as an exfoliating agent. The lysate of A. platensis was entrapped in a hydrogel formulation, which significantly improved its proteolytic stability over time. Storage of the lysate at 4 ℃ resulted in 50% reduction of its proteolytic activity within the first three days of measurements, while the hydrogel formulation didn’t exhibit any inactivation for at least 207 days of storage. Enzyme stability is a crucial advantage in the development of enzyme-based products for applications in cosmetic industry.