Τα παθογόνα στελέχη του εδαφογενούς μύκητα Fusarium oxysporum sensu stricto προσβάλλουν πολλά διαφορετικά είδη φυτών προκαλώντας ζημιές σε καλλιέργειες μεγάλης οικονομικής σημασίας, με σοβαρές οικονομικές και κοινωνικές επιπτώσεις. Στην παρούσα μελέτη, διερευνήθηκε ο ρόλος των γονιδίων του πρωτογενούς μεταβολισμού και συγκεκριμένα της β-αμυλόλυσης στην άμυνα φυτών Arabidopsis thaliana έναντι του φυτοπαθογόνου μύκητα F. oxysporum f. sp. raphani (For). Σε δοκιμές παθογένειας αξιολογήθηκε η ευπάθεια φυτών A. thaliana, γενετικά τροποποιημένων στα γονίδια που κωδικοποιούν τις τέσσερις χλωροπλαστικές β-αμυλάσες, BAM1, BAM2, BAM3 και BAM4, και των συνδυασμών τους στη μόλυνση με το For σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου (wt). Από όλες τις εξετασθείσες bam σειρές, τα φυτά με τη γενετική τροποποίηση στο BAM3 γονίδιο, που κωδικοποιεί το βασικότερο υδρολυτικό ένζυμο αποδόμησης του αμύλου, παρουσίασαν τη μικρότερη ευπάθεια στο For και στους ιστούς αυτών ανιχνεύτηκε η μικρότερη ποσότητα DNA του μύκητα με τη μέθοδο real-time PCR. Η μεταγραφομική και μεταβολομική ανάλυση με τη χρήση της τεχνολογίας των DNA μικροσυστοιχιών και της αέριας χρωματογραφίας-φασματομετρίας μάζας (GC/MS), αντίστοιχα, έδειξε ότι τόσο τα αμόλυντα όσο και τα μολυσμένα με το For wt και bam3 φυτά διέφεραν σε γονίδια και μεταβολίτες που σχετίζονται με το μεταβολισμό των υδατανθράκων, των αμινοξέων, τις φυτικές ορμόνες, τα κυτταρικά συστατικά και τις πρωτεΐνες του κυτταρικού τοιχώματος. Σχετικά με την αποδόμηση του αμύλου, μελετήθηκε η έκφραση των γονιδίων των β-αμυλασών BAM1, BAM2, BAM3 και BAM4, του ΑΜΥ3 που κωδικοποιεί την α-αμυλάση 3 οδηγώντας στο σχηματισμό γραμμικών και διακλαδισμένων ολιγοσακχαριτών, του ISA3 που κωδικοποιεί το ένζυμο για την υδρόλυση των σημείων διακλάδωσης και του DPE1 που κωδικοποιεί το D ένζυμο οδηγώντας σε παραγωγή γλυκόζης ή σε γραμμικούς ολιγοσακχαρίτες. Τα μεταγραφήματα του BAM3, που ήταν σημαντικά λιγότερα στα αμόλυντα bam3 φυτά σε σχέση με τα φυτά αγρίου τύπου λόγω της γενετικής τροποποίησης, αυξήθηκαν μετά τη μόλυνση με το For χωρίς να ξεπερνούν αυτά των wt. Τα παραπάνω συμφωνούν με τα αποτελέσματα της φωτομετρικής μέτρησης του αμύλου και της μαλτόζης στα φυτά των δύο γονοτύπων, σύμφωνα με τα οποία το παθογόνο προκάλεσε αύξηση της μαλτόζης και μείωση του αμύλου στα bam3 φυτά και αντιθέτως μείωση της μαλτόζης και αύξηση του αμύλου στα wt φυτά . Στα μολυσμένα bam3 φυτά αυξήθηκαν τα επίπεδα έκφρασης των ΒΑΜ1, BAM2, BAM4, AMY3, ISA3 και DPE1. Επομένως, η μόλυνση με το For επάγει τη ρύθμιση των ενζύμων της αποδόμησης του αμύλου οδηγώντας στην παραγωγή γλυκόζης και εν μέρει στην παραγωγή μαλτόζης στα bam3 φυτά. H ανάλυση του μεταβολισμού των υδατανθράκων έδειξε ότι στα πρώτα στάδια της μόλυνσης (3 μέρες μετά τη μόλυνση), τα bam3 φυτά περιείχαν λιγότερη D-γλυκόζη, η οποία στη συνέχεια (7 μέρες μετά τη μόλυνση) αυξήθηκε και ήταν περισσότερη σε σχέση με εκείνη των wt φυτών. Επίσης, η μόλυνση με το For αύξησε τη συγκέντρωση της σακχαρόζης, η οποία συμμετέχει στην άμυνα των φυτών έναντι των παθογόνων μέσω της υδρόλυσής της σε γλυκόζη, που με τη σειρά της ενεργοποιεί αμυντικές αποκρίσεις. Η μεταγραφική ρύθμιση των σχετιζόμενων με το μεταβολισμό της τρεχαλόζης γονιδίων TPS6 και TPP5 μετά τη μόλυνση των bam3 φυτών με το For οδήγησε σε μείωση της τρεχαλόζης στα φυτά του μεταλλάγματος, γεγονός που επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης, και πιθανόν να παίζει σημαντικό ρόλο στην άμυνα των bam3 φυτών έναντι του For, καθόσον η τρεχαλόζη και η πρόδρομος ένωσης αυτής, 6-φωσφορική τρεχαλόζη (T6P), θεωρούνται σημαντικά μόρια μετάδοσης σήματος που ρυθμίζουν το ισοζύγιο των υδατανθράκων και τις αμυντικές αποκρίσεις των φυτών έναντι των καταπονήσεων. Η μυο-ινοσιτόλη, σημαντικό σάκχαρο λόγω της συμμετοχής του σε πολλές διαφορετικές αναπτυξιακές και φυσιολογικές διεργασίες των ευκαρυωτικών κυττάρων, είχε αυξημένη συγκέντρωση στα bam3 φυτά σε σχέση με τα wt, παρουσία και απουσία του μύκητα, ενώ η συγκέντρωση της D-φωσφορικής μυο-ινοσιτόλης μειώθηκε στα φυτά του μεταλλάγματος μετά τη μόλυνση με το For. Τα γονίδια που καταλύουν την οξείδωση της μυο-ινοσιτόλης, MIOX1 και MIOX2, υπερεκφράστηκαν περισσότερο στα bam3 μολυσμένα φυτά σε σχέση με τα wt, υποδηλώνοντας ότι η μόλυνση με το For ενισχύει την οξειδωτική οδό του σακχάρου στα φυτά του μεταλλάγματος, ενεργοποιώντας εναλλακτικές πηγές γλυκανών για τη διατήρηση της μεταβολικής ομοιόστασης και οδηγώντας στο σχηματισμό του D-γλυκουρονικού οξέος για τη σύνθεση της πηκτίνης, βασικού συστατικού του πρωτογενούς κυτταρικού τοιχώματος. Ο παραπάνω ισχυρισμός επιβεβαιώνεται από τα αποτελέσματα της μέτρησης της συγκέντρωσης του γαλακτουρονικου οξέος (GalA) (ισοδύναμo της πηκτίνης), η οποία ήταν μεγαλύτερη στα φυτά του μεταλλάγματος σε σχέση με τα wt φυτά, παρουσία και απουσία του παθογόνου. Η δοκιμή διάχυσης σε πήκτωμα αγαρόζης πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων από wt και bam3 φυτά έδειξε ότι η δράση των πηκτινομεθυλεστερασών (PMEs) ήταν σημαντικά εντονότερη στα αμόλυντα bam3 φυτά, η οποία επιβεβαιώνεται από την υπερέκφραση των γονιδίων που κωδικοποιούν τις πηκτινομεθυλεστεράσες PME1, PME3 και PME41 (ATPMEPCRB) στα αμόλυντα bam3 φυτά σε σχέση με τα αμόλυντα wt φυτά. Η μόλυνση με το παθογόνο μείωσε τη δράση των PMEs στα πρώτα στάδια της μόλυνσης (3 μέρες μετά τη μόλυνση), μείωση η οποία φαίνεται ότι συσχετίζεται με την υποέκφραση του PME41 και την υπερέκφραση του PMEI7 που κωδικοποιεί τον παρεμποδιστή της πηκτινομεθυλεστεράσης 7. Επίσης, ο ανοσοεντοπισμός ομογαλακτουρονανών (βασικό συστατικό της πηκτίνης) με διαφορετικό βαθμό μεθυλίωσης (DM) στα τοιχώματα των κυττάρων των ιστών του στελέχους και του υποκοτυλίου έδειξε ότι τα αμόλυντα bam3 φυτά περιείχαν περισσότερη πηκτίνη, τόσο με χαμηλό DM όσο και με υψηλό DM. Το For προκάλεσε αύξηση της έντονα μεθυλιωμένης πηκτίνης και μείωση της λιγότερο μεθυλιωμένης πηκτίνης στα bam3 φυτά. Από τα παραπάνω συνάγεται το συμπέρασμα ότι η μειωμένη ευπάθεια στο For των bam3 φυτών σχετίζεται με την αύξηση της περιεκτικότητας της πηκτίνης των φυτών του μεταλλάγματος και τη ρύθμιση του βαθμού μεθυλίωσης αυτής μέσω της μεταγραφικής ρύθμισης των γονιδίων που κωδικοποιούν PMEs και παρεμποδοστές αυτών (PME41, PMEI7)οδηγώντας στην παραγωγή έντονα μεθυλιωμένης πηκτίνης, γεγονός που καθιστά τα κυτταρικά τοιχώματα των bam3 φυτών λιγότερο ευάλωτα στον μύκητα For. Επίσης, η μόλυνση των bam3 φυτών με το For διαφοροποίησε την έκφραση των XTH24, XTH31 και EXP8, που κωδικοποιούν ένζυμα χαλάρωσης του δικτύου κυτταρίνης-ξυλογλυκάνης. Συγκεκριμένα, το XTH31 υποεκφράστηκε στα bam3 φυτά και στους 2 χρόνους μετά τη μόλυνση με το παθογόνο και πιθανόν να περιορίζει τη χαλάρωση των κυτταρικών τοιχωμάτων των φυτών του μεταλλάγματος παρεμποδίζοντας την είσοδο του μύκητα. Όσον αφορά τις φυτορμόνες, η επαγόμενη από το σαλικυλικό οξύ (SA) οδός μεταγωγής σήματος φαίνεται να εμπλέκεται στην άμυνα των bam3 φυτών A. thaliana έναντι του For, αφού τα μεταγραφικά επίπεδα του γονίδιου PR1 (δείκτης ενεργοποίησης της επαγόμενης από το SA άμυνας) ήταν υψηλότερα στα φυτά του μεταλλάγματος σε σχέση με τα wt. Επίσης, η προκαλούμενη από το For υπερέκφραση των γονιδίων που σχετίζονται με την επαγόμενη από το αιθυλένιο (ET) οδό μεταγωγής σήματος PDF1.2, ACS8 και ERF11, και του MYC2 που κωδικοποιεί μεταγραφικό ρυθμιστή του μονοπατιού του ιασμονικού οξέος (JA) στα φυτά του μεταλλάγματος υποδηλώνει την πιθανή συνέργεια των μονοπατιών των SA και ET/JA στην άμυνα των bam3 φυτών έναντι του For. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της μεταβολομικής ανάλυσης, οι πρόδρομες ενώσεις του ινδολ-3-οξικού οξέος (ΙΑΑ), ινδολο-3-λακτικό οξύ και 1H-ινδολο-3-ακετονιτρίλιο, αυξήθηκαν σημαντικά στα μολυσμένα και αμόλυντα bam3 φυτά σε σχέση με τα αντίστοιχα wt. Επίσης, στα μολυσμένα φυτά του μεταλλάγματος αυξήθηκαν τα μεταγραφικά επίπεδα του GH3.3 που κωδικοποιεί τη συνδετάση που ενώνει το IAA με αμινοξέα, και του DRM2 που σχετίζεται με τη μεταφορά της αυξίνης. Δεδομένου ότι οι πρωτεΐνες GH3 συμβάλλουν στη διατήρηση της ομοιόστασης της αυξίνης οδηγώντας στην εξασθένιση του βοηθητικού προγράμματος ανάπτυξης προκειμένου να δοθεί προτεραιότητα σε αμυντικούς μηχανισμούς, και οι DRM πρωτεΐνες σχετίζονται με αμυντικές αποκρίσεις έναντι βιοτικών και αβιοτικών καταπονήσεων, ο μεταβολισμός της αυξίνης φαίνεται να εμπλέκεται στις αμυντικές αποκρίσεις των bam3 φυτών έναντι του For. Η παρούσα μελέτη έδειξε ότι η πρωτεΐνη BAM3 αποτελεί αρνητικό ρυθμιστή της ανθεκτικότητας έναντι του φυτοπαθογόνου μύκητα F. oxysporum και ως εκ τούτου θα μπορούσε να αξιοποιηθεί για τη δημιουργία ανθεκτικών στο F. oxysporum ποικιλιών. Η δε άμυνα των bam3 φυτών σχετίζεται με τη ρύθμιση των ενζύμων της αποδόμησης του αμύλου, τροποποιήσεις στο μεταβολισμό των σακχάρων (γλυκόζη, σακχαρόζη, τρεχαλόζη και μυο-ινοσιτόλη) και της αυξίνης, τη συνέργεια των επαγόμενων από SA και ET/JA οδών μεταγωγής σήματος και την ενίσχυση των κυτταρικών τοιχωμάτων σε πηκτίνη με υψηλό βαθμό μεθυλίωσης που καθιστά τα κυτταρικά τοιχώματα των φυτών του μεταλλάγματος λιγότερο ευάλωτα στην προσβολή από το παθογόνο.
Pathogenic strains of the soil-borne fungus Fusarium oxysporum sensu stricto infect many different plant species causing severe damage in many agricultural crops of great economic importance with serious economic and social impacts. The present study investigated the role of genes of the primary metabolism and in particular of β-amylolysis in Arabidopsis thaliana defense against the phytopathogenic fungus F. oxysporum f. sp. raphani (For). Pathogenicity tests were conducted to evaluate the susceptibility to For of A. thaliana mutants impaired to the genes encoding the four chloroplastic β-amylases BAM1, BAM2, BAM3, and BAM4, and their combinations compared to wild-type plants (wt). Among the investigated bam mutants, the genotype with disruption of BAM3, which encodes the major hydrolytic enzyme that degrades starch to maltose, was the least susceptible to For and had the smallest amount of fungal DNA in the vascular tissues using real-time qPCR. Transcriptional and metabolic analysis using microarray DNA technology and gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS), respectively, showed that the wt and bam3 plants have different transcriptional and metabolic profiles, both in the presence and absence of the pathogen. Specifically, wt and bam3 plants inoculated with For differed in genes and metabolites related to the metabolism of carbohydrates, amino acids, plant hormones, structure and composition of cell walls. Regarding starch degradation, the expression of the following genes was studied: BAM1, BAM2, BAM3 and BAM4 encoding β-amylases, AMY3 encoding α-amylase 3 leading to the formation of linear and branched oligosaccharides, ISA3 encoding the enzyme for the hydrolysis at branching points and DPE1 encoding the D enzyme leading to glucose production or to linear oligosaccharides. BAM3 transcripts, which were significantly lower in non-inoculated (mock) bam3 plants due to the mutation, increased after inoculation with For, but they were not higher than those of wt. The above is in line with the results of the photometric measurement of starch and maltose, according to which the pathogen increased maltose and decreased starch in bam3 mutants while it decreased maltose and increased starch in wt plants. For-inoculated bam3 plants showed increased expression of BAM1, BAM2, BAM4, AMY3, ISA3 and DPE1. Therefore, inoculation with For induced the regulation of starch degradation enzymes leading to glucose production and partly to maltose production in bam3 mutants. The analysis of carbohydrate metabolism showed that For-inoculated bam3 mutants contained less D-glucose in the early stages of inoculation (3 days post inoculation), while later (7 days post inoculation) the level of the sugar was increased and was higher compared to wt plants. For inoculation increased sucrose concentration, which, through its hydrolysis to glucose, has emerged as an important molecule in plant sugar signaling networks modulating the innate immunity and defense responses during microbial attack. Transcriptional regulation of TPS6 and TPP5, genes involved in trehalose metabolism, resulted in a reduction in trehalose concentration in mutants, which is in consistent with the results of the metabolic analysis and seems to play an important role in bam3 resistance to Fusarium wilt, since trehalose and its precursor trehalose-6-phosphate (T6P) are important signaling metabolites regulating carbon assimilation and sugar status in plants stimulating plant defense response. Myo-inositol, an important sugar for many different developmental and physiological processes in eukaryotic cells, had an increased concentration in mock and For-inoculated bam3 mutants compared to wt, while the concentration of D-myo-Inositol-1-phosphate was reduced in the mutant plants after inoculation with For. MIOX1 and MIOX2 (myo-inositol oxygenase 1 and 2), that catalyze the oxidation of myo-inositol, were upregulated in inoculated bam3 plants, suggesting that For inoculation enhances the oxidative pathway of myo-inositol in mutants inducing alternative sources of glucans for maintaining metabolic homeostasis and leading to the formation of D-glucuronic acid, a precursor for the synthesis of cell wall pectic non-cellulosic compounds, especially pectin which is a key component of the primary cell wall. In confirmation of the above, the colorimetric assay for galacturonic acid (GalA) (pectin equivalent) showed that mock and For-inoculated mutants contained more pectin than the wt. The agar gel diffusion assay of protein extracts from wt and bam3 plants revealed that the pectin methylesterase (PMEs) activity was very intense in mock bam3 mutants, which is in line with the overexpression of the genes encoding pectin methylesterases PME1, PME3 and PME41 (ATPMEPCRB) in mock bam3 plants. For inoculation decreased PME activity in the early stages of inoculation (3 days post inoculation), a decrease which appears to be correlated with the underexpression of PME41 and the overexpression of PMEI7 encoding the pectin methylesterase inhibitor 7. Immunofluorescence labelling of homogalacturonan (main component of pectin) with various degrees of methylation (DM) of cell walls in stem and hypocotyls cells showed that mock bam3 plants contained more pectin, with low and high DM. In contrast, For inoculation increased the immunofluorescence of highly methylesterified pectin and decreased that of less methylesterified pectin in mutants. The above results demonstrate that the immune response of bam3 mutant against For is related to the increase of pectin content and the regulation of pectin methylation through the transcriptional regulation of genes encoding PMEs and PMEIs (PME41, PMEI7), leading to the production of highly methylesterified pectin which makes cell walls less vulnerable to For. For inoculation differentiated the expression of XTH24, XTH31 and EXP8, which encode cellulose-xyloglycan network-loosening enzymes, in bam3 plants. In particular, XTH31 was downregulated in bam3 plants at both time points post inoculation and thus it may be related to immune responses against For by preventing the fungal entry due to reduction of cell wall loosening. Concerning phytohormones, the SA signaling pathway appears to be involved in the defense of bam3 mutant against For, since the transcriptional levels of PR1 (a marker gene of SA-induced defense) were higher in mutant plants than in wt. In addition, For caused overexpression of PDF1.2, ACS8 and ERF11, genes related to ET signaling pathway, and MYC2, a transcriptional regulator of JA signaling, indicating a potential interplay between the signaling pathways of SA and ET/JA in bam3 defense against For. According to metabolic analysis, the precursors of indol-3-acetic acid (IAA), indole-3-lactic acid and 1H-indole-3-acetonitrile, increased significantly in mock and For-inoculated bam3 plants compared to the wt ones. Additionally, GH3.3, encoding a synthetase that conjugates IAA to amino acids, and DRM2, involved in auxin polar transport, were overexpressed in inoculated bam3 plants. Auxin metabolism seems to be involved in defense responses of bam3 plants against For, since GH3 proteins maintain auxin homeostasis leading to attenuation of development to prioritize defense mechanisms and DRM proteins are associated with defense responses to biotic and abiotic stress. The present study showed that BAM3 protein is a negative regulator in plant defense against F. oxysporum and can be used for genetic modification of crops in the development of Fusarium-tolerant germplasm and cultivars. The immune responses of bam3 mutants are related to the regulation of starch degradation enzymes, alterations in sugar metabolism (glucose, sucrose, trehalose and myo-inositol) and auxin metabolism, activation of an interplay between signaling pathways of SA and ET/JA and the reinforcement of cell walls in pectin with a high degree of methylation making the cell walls of bam3 mutant less vulnerable to For attack.
