Η αυξημένη ζήτηση και παραγωγή κτηνοτροφικών προϊόντων υψηλής διατροφικής αξίας λόγω αύξησης του παγκόσμιου πληθυσμού και των προτιμήσεων των καταναλωτών, ιδιαίτερα στις αναπτυσσόμενες χώρες που χαρακτηρίζονται από ευημερία, οδηγεί στη μελέτη καινοτόμων ζωοτροφών. Οι ζωοτροφές αυτές είναι πλούσιες σε βιολειτουργικά συστατικά, όπως τα πολυακόρεστα λιπαρά οξέα (polyunsaturated fatty acids, PUFA) και τα αντιοξειδωτικά τα οποία συμβάλουν στην ενίσχυση της ποιότητας των κτηνοτροφικών προϊόντων, όπως το γάλα, ενισχύουν το ανοσοποιητικό σύστημα των ζώων γεγονός που μπορεί να οδηγήσει στον περιορισμό της χρήσης των αντιβιοτικών και κατ’ επέκταση της αντίστασης στα αντιβιοτικά πέραν της μείωσης του κόστους παραγωγής. Επίσης, δύνανται να τροποποιούν το μικροβίωμα της μεγάλης κοιλίας (Μ.Κ.) των μηρυκαστικών. Η σπουδαιότητα στην τροποποίηση του μικροβιώματος της Μ.Κ. έγκειται στο γεγονός ότι αυτό είναι αρχικά υπεύθυνο για την αποδόμηση των PUFA σε κορεσμένα λιπαρά οξέα (saturated fatty acids, SFA) τα οποία μεταφέρονται στο αίμα και στη συνέχεια στο παραγόμενο γάλα, αλλά και στο ότι συγκεκριμένοι μικροοργανισμοί (μεθανοβακτήρια) είναι υπεύθυνοι για την παραγωγή ενός από τα σημαντικότερα αέρια του θερμοκηπίου, το μεθάνιο (CH4).
Επομένως, σκοπός των δύο πειραματισμών της διδακτορικής διατριβής ήταν η διερεύνηση της επίδρασης τριών διαφορετικών επιπέδων ενσωμάτωσης και η αξιολόγηση του βέλτιστου επιπέδου ενσωμάτωσης δύο διαφορετικών διατροφικών καινοτόμων ζωοτροφών και συγκεκριμένα των σπερμάτων καμελίνας (Camelina sativa seeds, CS) και της σπιρουλίνας (Spirulina, SP) α) στη γαλακτοπαραγωγή και στη χημική σύσταση του γάλακτος, β) στο προφίλ των λιπαρών οξέων του υγρού της Μ.Κ. (Υ.Μ.Κ.), του πλάσματος του αίματος και του γάλακτος, γ) στην έκφραση επιλεγμένων γονιδίων που σχετίζονται με τη ρύθμιση του ανοσοποιητικού συστήματος και δ) στη σχετική αφθονία μικροοργανισμών στο υγρό και στερεό περιεχόμενο της Μ.Κ.
Για τον πρώτο πειραματισμό, σαράντα οκτώ (48) προβατίνες φυλής Χίου επιλέχθηκαν και χωρίστηκαν σε τέσσερις ισοδύναμες ομάδες (n = 12) από πλευράς διορθωμένης ως προς τη λιποπεριεκτικότητα γαλακτοπαραγωγής (6 %) (1,85 ± 0,3 kg/ημέρα), ηλικίας (2 - 4), ημέρες γαλακτικής περιόδου (67 ± 8) και σωματικού βάρους (55.0 ± 6,5 kg). Τα ζώα σταβλίζονταν ομαδικά ανά ομάδα και για τη διατροφή τους μεταφέρονταν σε ειδικά διαμορφωμένα ατομικά κελιά προκειμένου να επιτευχθεί ατομική διατροφή. Οι προβατίνες τρέφονταν ατομικά με σανό μηδικής, άχυρο σίτου και μείγμα συμπυκνωμένων ζωοτροφών (ΣΖ). Το μείγμα ΣΖ της ομάδας του μάρτυρα (CON) δεν περιείχε σπέρματα καμελίνας, ενώ στις υπόλοιπες τρεις διατροφικές επεμβάσεις, σπέρματα καμελίνας ενσωματώθηκαν στα μείγματα ΣΖ σε ποσοστά 6 % (CS6), 11 % (CS11) και 16 % (CS16), προς μερική αντικατάσταση του σογιάλευρου και του αραβοσίτου. Η χορήγηση του σιτηρεσίου γινόταν δύο φορές ημερησίως σε ισάριθμες ποσότητες, μετά το πέρας της μηχανικής άμελξης.
Η ενσωμάτωση σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα ΣΖ δεν επηρέασε τη γαλακτοπαραγωγή, ενώ όσον αφορά τη χημική σύσταση του γάλακτος, στην ομάδα CS16 η λιποπεριεκτικότητα του μειώθηκε σημαντικά σε σύγκριση με την CON (P = 0,046). Η ενσωμάτωση σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα ΣΖ, βελτίωσε την ποιότητα του γάλακτος τροποποιώντας τη συγκέντρωση σε SFA (P < 0,001), α-λινολενικό (C18:3 n-3) (P < 0,001), cis-9, trans-11 C18:2 (CLA) (P < 0,001) και τον λόγο ω6/ω3 (P < 0,001) προς την επιθυμητή κατεύθυνση για τον καταναλωτή. Επιπλέον, στο πλάσμα του αίματος, η δραστικότητα της καταλάσης (CAT) αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,006) στις ομάδες CS11 και CS16 και η δραστικότητα της δισμουτάσης του υπεροξειδίου (SOD) αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,014) στη CS16. Επίσης, η ολική αντιοξειδωτική κατάσταση αυξήθηκε στις ομάδες CS σύμφωνα τις μεθόδους ABTS (P < 0,001) και FRAP (P = 0,008). Ωστόσο, τα επίπεδα της μηλονικής διαλδεΰδης (MDA), βιοδείκτη οξειδωτικού στρες, αυξήθηκαν σημαντικά (P < 0,001) για την ομάδα CS11 σε σύγκριση με τις CON και CS6 και για την ομάδα CS16 σε σύγκριση με την CS6. Στην ομάδα CS16, τα πρωτεϊνικά καρβονύλια (PC) αυξήθηκαν σημαντικά (P < 0,001). Τέλος, στις ομάδες CS, η οξειδωτική σταθερότητα του γάλακτος ενισχύθηκε, όπως υποδηλώθηκε από τις τροποποιήσεις (P < 0,050) στις δραστικότητες των SOD, CAT και της υπεροξειδάσης της γλουταθειόνης (GSH-Px), στην ολική αντιοξειδωτική ικανότητα και στους βιοδείκτες οξειδωτικού στρες.
Για τον προσδιορισμό των σχετικών επιπέδων έκφρασης των γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία των προβατινών, χρησιμοποιήθηκε πλατφόρμα PCR πραγματικού χρόνου (RT-PCR). Τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων της ιντερφερόνης-β (TRIF) (P = 0,005), του σχετιζόμενου με τον υποδοχέα TNF παράγοντα 3 (TRAF3) (P = 0,010), του ρυθμιστικού παράγοντα 5 ιντερφερόνης (IRF5) (P = 0,002) και της ενεργοποιημένης από μιτογόνο πρωτεϊνικής κινάσης (MAPK) (P = 0,005) που επάγει τον προσαρμογέα TIR, αυξήθηκαν στα μονοκύτταρα των προβατινών της ομάδας CS11. Επιπλέον, στα μονοκύτταρα των προβατινών της CS6, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του γονιδίου της ιντερλευκίνης-1 βήτα (IL1B) αυξήθηκαν (P = 0,015) σε σύγκριση με την CON, ενώ στα ουδετερόφιλα της ίδιας ομάδας τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων IL1B (P < 0,001), Ιντερλευκίνης-8 (IL8) (P = 0,017) και Ιντερλευκίνης-10 (IL10) (P = 0,007) αυξήθηκαν σε σύγκριση με τις CON και CS16. H απόκριση των μονοκυττάρων σχετίζεται με τις διαφορές που παρατηρήθηκαν στο προφίλ των αμινοξέων (κυρίως θρεονίνη, τυροσίνη, σερίνη και λυσίνη) των τεσσάρων μειγμάτων ΣΖ και είναι διαφορετική από αυτή των ουδετερόφιλων.
Η σχετική αφθονία των μικροοργανισμών της Μ.Κ. προσδιορίστηκε μέσω πλατφόρμας RT-qPCR. Η σχετική αφθονία των αρχαίων (P < 0,001) και των μεθανοβακτηρίων (P = 0,025) μειώθηκε σημαντικά στο στερεό περιεχόμενο των CS11 και CS16. Επιπλέον, η σχετική αφθονία των πρωτοζώων αυξήθηκε σημαντικά τόσο στο υγρό (P < 0,001) όσο και στο στερεό περιεχόμενο (P = 0,010) της Μ.Κ. της CS6, ενώ αυτή των μυκήτων μειώθηκε σημαντικά (P = 0,043) στο στερεό περιεχόμενο της CS16. Στο Υ.Μ.Κ., η σχετική αφθονία των Fibrobacter succinogens (P < 0,001) και Ruminobacter amylophilus (P = 0,002) αυξήθηκε σημαντικά στις CS6 και CS11, αντίστοιχα. Στο στερεό περιεχόμενο της CS11, η σχετική αφθονία του είδους Ruminococcus flavefaciens μειώθηκε σημαντικά (P = 0,022), ενώ των Ruminobacter amylophilus (P < 0.001) και Butyrivibrio proteoclasticus (P = 0.001) αυξήθηκε σημαντικά. Επίσης, η σχετική αφθονία του είδους Selenomonas ruminantium αυξήθηκε σημαντικά (P = 0.001) στο στερεό περιεχόμενο των CS11 και CS16.
Συμπερασματικά, η ενσωμάτωση σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα ΣΖ των προβατινών βελτίωσε το προφίλ των λιπαρών οξέων και την οξειδωτική σταθερότητα του γάλακτος προς την επιθυμητή για τον καταναλωτή κατεύθυνση. Επίσης, το υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης σπερμάτων καμελίνας στα μείγματα των ΣΖ (CS16) δεν είχε αρνητικό αντίκτυπο στην έκφραση γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία των προβατινών. Τέλος, η μείωση των μεθανοβακτηρίων και οι τροποποιήσεις στον βακτηριακό πληθυσμό των προβατινών της ομάδας CS16, αναδεικνύουν σημαντικά ευρήματα σχετικά τόσο με τη μείωση των εκπομπών CH4 και κατ’ επέκταση τη μείωση του περιβαλλοντικού αποτυπώματος μίας κτηνοτροφικής εκμετάλλευσης, όσο και για τις ζυμωτικές διεργασίες εντός της Μ.Κ., καθώς οι τροποποιήσεις αυτές δεν επηρέασαν αρνητικά την παραγωγικότητα.
Για τον δεύτερο πειραματισμό της διδακτορικής διατριβής, 48 προβατίνες φυλής Χίου επιλέχθηκαν και κατανεμήθηκαν σε 4 ισοδύναμες ομάδες (n = 12) από πλευράς διορθωμένης ως προς τη λιποπεριεκτικότητα γαλακτοπαραγωγής (6 %) (1,85 ± 0,3 kg/ημέρα), ηλικίας (2 - 4), ημέρες γαλακτικής περιόδου (67 ± 8) και σωματικού βάρους (54 ± 6 kg). Οι προβατίνες σταβλίζονταν ομαδικά ανά ομάδα και για τη διατροφή τους μεταφέρονταν σε ειδικά διαμορφωμένα ατομικά κελιά προκειμένου να επιτευχθεί ατομική διατροφή. Οι προβατίνες κατανάλωναν ημερησίως σανό μηδικής, άχυρο σίτου και μείγμα ΣΖ. Η ομάδα του μάρτυρα (CON) κατανάλωνε βασικό σιτηρέσιο χωρίς την ενσωμάτωση σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ, ενώ ανά ζώο σε ημερήσια βάση στις υπόλοιπες τρεις διατροφικές επεμβάσεις, 5 g (SP5), 10 g (SP10) και 15 g (SP15) σπιρουλίνας ενσωματώθηκαν ως πρόσθετο στα μείγματα ΣΖ. Η διάθεση του σιτηρεσίου γινόταν δύο φορές ημερησίως σε ισάριθμες ποσότητες, μετά τη μηχανική άμελξη.
Η γαλακτοπαραγωγή και η χημική σύσταση του γάλακτος δεν επηρεάστηκαν από την προσθήκη σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ. Η συγκέντρωση των λιπαρών οξέων μικρής αλύσου αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,001) στο γάλα των προβατινών των ομάδων SP5 και SP10 ενώ των μεσαίας αλύσου μειώθηκε σημαντικά (P = 0,024) στο γάλα της SP10 σε σύγκριση με την CON. Η προσθήκη σπιρουλίνας στο υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης (SP15) στα μείγματα ΣΖ ενίσχυσε τη συγκέντρωση των PUFA (P = 0,027) και μείωσε τον δείκτη θρομβογένεσης (P = 0,046) στο γάλα. Σχετικά με την οξειδωτική κατάσταση των προβατινών, η δραστικότητα της SOD αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,014) στις ομάδες SP. Το ίδιο παρατηρήθηκε για τις δραστικότητες της CAT (P = 0,031), της GSH-Px (P < 0,001) και της μεταφοράσης της γλουταθειόνης (GST) (P = 0,026) στο πλάσμα του αίματος των προβατινών των ομάδων SP10, SP15 και SP5, αντίστοιχα. Αντίθετα, τα επίπεδα των PC μειώθηκαν (P < 0,001) στο πλάσμα του αίματος των προβατινών των ομάδων SP. Η οξειδωτική σταθερότητα του πρόβειου γάλακτος βελτιώθηκε για τις ομάδες SP, όπως αποδείχθηκε από την αύξηση της δραστικότητας των SOD (P = 0,007), CAT (P = 0,011) και GSH-Px (P < 0,001) και της ολικής αντιοξειδωτικής ικανότητας [προσδιορισμένη με της μεθόδους ABTS και FRAP (P < 0,001)]. Τέλος, το υψηλότερο επίπεδο ενσωμάτωσης σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ (SP15) προκάλεσε τη μεγαλύτερη μείωση (P = 0,034) στο επίπεδο των PC στο γάλα.
Επιπλέον, στα μονοκύτταρα των προβατινών της SP5 αυξήθηκαν σημαντικά τα σχετικά επίπεδα έκφρασης των γονιδίων TRIF (P = 0,012), MAPK (P = 0,010) και JUND (P = 0,008) σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ομάδες και τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του IRF5 αυξήθηκαν σημαντικά (P = 0,016) σε σύγκριση με την CON. Στα ουδετερόφιλα, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του MYD88 μειώθηκαν σημαντικά (P < 0,001) στις ομάδες SP10 και SP15 σε σύγκριση με την CON, ενώ του NFKB μειώθηκαν σημαντικά (P = 0,010) στην ομάδα SP10 σε σύγκριση με την CON. Επίσης, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του STAT3 μειώθηκαν σημαντικά (P < 0,001) στις ομάδες SP. Αντίθετα, τα σχετικά επίπεδα έκφρασης του TRIF αυξήθηκαν σημαντικά (P = 0,011) στην SP5 σε σύγκριση με τις υπόλοιπες ομάδες.
Στο Υ.Μ.Κ. η σχετική αφθονία του είδους Prevotella brevis αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,001) στις SP5 και SP10 σε σύγκριση με τις CON και SP15. Επίσης, η σχετική αφθονία του Ruminobacter amylophilus μειώθηκε σημαντικά (P = 0,012) στην ομάδα SP10, ενώ στην SP15 η σχετική αφθονία των Fibrobacter succinogenes και Eubacterium ruminantium αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,008 και P = 0,005, αντίστοιχα). Στο στερεό περιεχόμενο, η σχετική αφθονία των Fibrobacter succinogenes στις SP5 και SP10 και Selenomonas ruminantium στις SP5 και SP15 μειώθηκε σημαντικά (P = 0,017 και P = 0,001, αντίστοιχα) σε σύγκριση με την CON. Επιπλέον, η σχετική αφθονία των Ruminobacter amylophilus (P < 0.001) και Streptococcus bovis (P < 0.001) μειώθηκε σημαντικά στις ομάδες SP, ενώ του είδους Ruminococcus albus αυξήθηκε σημαντικά (P = 0,046) στην SP15 σε σύγκριση με την CON.
Εν κατακλείδι, το μεγαλύτερο επίπεδο ενσωμάτωσης σπιρουλίνας στα μείγματα ΣΖ των προβατινών (15 g/προβατίνα/ημέρα, SP15), βελτίωσε την ποιότητα του παραγόμενου γάλακτος διασφαλίζοντας και την υγεία των προβατινών, όπως διαπιστώθηκε από τη μελέτη του προφίλ των λιπαρών οξέων και της οξειδωτικής σταθερότητας του γάλακτος, της οξειδωτικής κατάστασης του οργανισμού, της σχετικής έκφρασης γονιδίων που σχετίζονται με την έμφυτη ανοσία και του μικροβιώματος της μεγάλης κοιλίας.
The need for increased animal productivity because of the global population rise, as well as the rapid increase in demand for high nutritional animal products due to consumer preferences and emerging markets existing mainly in developing countries characterized by prosperity, drive the scientific community in studying innovative, unconventional, and high nutritional feedstuffs. The supplementation with feedstuffs rich in bioactive compounds such as polyunsaturated fatty acids (PUFA) and antioxidants in animal diets, could contribute to the development of high-nutritional dairy products. These bioactive compounds, ensure the fortification of the immune system and animal health, thus, reducing the use of antibiotics and consequently antibiotic resistance, ensuring profitability for dairy farms. Such feeding strategies are also associated with important alterations in the rumen microorganisms. The importance of modifying the rumen microorganisms lies not only in their ability to the breakdown of PUFA into saturated fatty acids (SFA) which are transferred in blood and then in milk, but also in the fact that specific microorganisms (methanogens) are linked with methane (CH4) production, and therefore, livestock’s environmental impact.
Considering the abovementioned, the purpose of this Ph.D. thesis is the investigation of the effect of three different supplementation levels and the evaluation of the optimum level of two innovative feedstuffs, specifically Camelina sativa seeds, (CS), and Spirulina (SP): (a) on milk yield and its chemical composition, b) on rumen fluid, blood plasma, and milk fatty acids profile, c) on the expression of selected genes related to the regulation of the immune system and d) on rumen microorganisms.
For the first experiment, 48 Chios breed ewes were allocated into four equal and homogenous groups, in terms of fat-corrected milk yield (6 %) (1.85 ± 0.3 kg/day), age (2 - 4), days in milk (67 ± 8) and body weight (55.0 ± 6.5 kg). Animals were housed in groups and during feeding time, they were transferred to specially designed individual pens to achieve individual feeding. The rations consisted of concentrate, alfalfa hay, and wheat straw, and were offered in equal proportions, twice per day, after milking. Each group was assigned to one of the following four dietary treatments: CON: control diet without the CS supplementation; CS6: concentrate with 6 % of CS; CS11: concentrate with 11 % of CS, and CS16: concentrate with 16 % of CS. In the three CS dietary treatments, CS partially substituted both soybean meal and maize grain.
Supplementing CS at 6 % and 11 %, had no impact on milk yield and chemical composition, while in the CS16, milk fat was significantly decreased compared to the CON. In the CS groups, milk quality was improved from a human health perspective considering the proportions of SFA (P < 0.001), a-linolenic acid (C18:3 n-3) (P < 0.001), cis-9, trans-11 C18:2 (CLA) (P < 0.001), and the ω6/ω3 ratio (P < 0.001). Furthermore, in blood plasma, the activity of catalase (CAT) was significantly increased (P = 0.006) in the CS11 and CS16, and the activity of superoxide dismutase (SOD) was significantly increased (P = 0.014) in the CS16. In addition, the total antioxidant capacity was increased in the CS-fed ewes considering both ABTS (P < 0.001) and FRAP (P = 0.008) methods. The levels of malondialdehyde (MDA) were significantly increased (P < 0.001) in the CS11 compared to the CON and CS6, and in the CS16 compared to the CS6. In the CS16, protein carbonyls (PC) were significantly increased (P < 0.001). Finally, in the CS-fed ewes, milk oxidative stability was fortified, as suggested by the activities of SOD, CAT, and glutathione peroxidase (GSH-Px), by the total antioxidant capacity, and the levels of the oxidative stress biomarkers.
The relative transcript levels of the immune-related genes were determined using a real-time PCR platform (RT-PCR). The relative transcript levels of TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β (TRIF) (P = 0.005), TNF receptor-associated factor 3 (TRAF3) (P = 0.010), Interferon regulatory factor 5 (IRF5) (P = 0.002), and Mitogen-activated protein kinase (MAPK) (P = 0.005) were significantly increased in monocytes of the CS11 fed ewes. Furthermore, in monocytes of the CS6-fed ewes, the relative transcript levels of Interleukin-1 beta (IL1B) were significantly increased (P = 0.015) compared to the CON, while in neutrophils, those of IL1B (P < 0,001), Interleukin-8 (IL8) (P = 0.017), and Interleukin-10 (IL10) (P = 0.007) were significantly increased compared to the CON and CS16 fed ewes. The response of monocytes to dietary amino acids (mainly threonine, tyrosine, serine, and lysine) changes related to CS inclusion were different from that of neutrophils. However, the observed responses need to be further investigated.
Rumen microorganisms’ relative abundance was determined using a RT-qPCR platform. The relative abundance of the archaea (P < 0.001) and methanogens (P = 0.025) was significantly reduced in rumen solid particles of the CS11 and CS16. In addition, the relative abundance of the protozoa of the CS6 was significantly increased in both the rumen fluid (P < 0.001) and solid particles (P = 0.010), while that of fungi was significantly reduced (P = 0.043) in the CS16. Furthermore, in rumen fluid, the relative abundance of the Fibrobacter succinogens (P < 0.001) and Ruminobacter amylophilus (P = 0.002) was significantly increased in the CS6 and CS11, respectively. In rumen solid particles of the CS11, the relative abundance of the Ruminococcus flavefaciens was significantly reduced (P = 0.022), while that of Ruminobacter amylophilus (P < 0.001) and Butyrivibrio proteoclasticus (P = 0.001) was significantly increased. Lastly, the relative abundance of Selenomonas ruminantium was significantly increased (P = 0.001) in the rumen particles of the CS11 and CS16.
In conclusion, supplementing CS in ewes’ diets, improved milk fatty acid profile, milk oxidative stability as well as total antioxidant capacity. The highest level of CS supplementation (CS16) did not have a negative impact on ewes’ innate immunity. Finally, the highest CS supplementation reduced the relative abundance of methanogens without inducing radical changes in rumen microorganisms that could impair ruminal fermentation and ewes’ performance, thus, highlighting important findings regarding both the reduction of CH4 emissions and consequently, the reduction of the environmental footprint, as well as rumen fermentation processes.
For the second trial of this doctoral dissertation, 48 Chios breed ewes were selected and allocated in 4 homogenous groups (n = 12) in terms of fat-corrected (6 %) milk yield (1.85 ± 0.3 kg/day), age (2 - 4), days in milk (67 ± 8) and body weight (54 ± 6 kg). Animals were kept in a common stall, divided into different blocks for each group, and at feeding time they were transferred to individual pens to achieve individual feeding. Each ewe was fed individually based on its maintenance and lactating requirements and the rations consisted of concentrates, alfalfa hay, and wheat straw, and were administered twice per day, after milking, independently of the groups. The concentrate of the control group (CON) had no SP, while in the concentrates of the treated groups, SP was added to obtain a daily supply of 5 g (SP5), 10 g (SP10), and 15 g (SP15) per animal.
The milk yield and chemical composition were not affected by the SP administration. The proportion of short-chain fatty acids was increased (P = 0.001) in the milk of SP5 and SP10 ewes while those of medium-chain fatty acids were reduced (P = 0.024) in the milk of SP10 compared with the CON animals. The highest SP supplementation level (SP15) increased the proportion of PUFA (P = 0.027) in milk and reduced the thrombogenicity index (P = 0.046). Furthermore, ewes’ milk oxidative stability was improved by the dietary supplementation of SP as indicated by the increase in the activities of SOD (P = 0.007), CAT (P = 0.011) και GSH-Px (P < 0.001), and the total antioxidant capacity [measured by FRAP and ABTS assays (P < 0,001)] as well. Finally, the highest inclusion level of SP caused the sharpest drop (P = 0.034) in the PC content of milk. In conclusion, the highest inclusion level of SP (SP15) improved ewes’ oxidative status as well as their milk quality and oxidative stability. Moreover, the activity of SOD was significantly increased (P = 0.014) in the blood plasma of SP-fed ewes. The same was observed for the activities of CAT (P = 0.031), GSH-Px (P < 0.001), and glutathione transferase (P = 0.026) in the blood plasma of SP10, SP15, and SP5-fed ewes, respectively. On the contrary, PC were significantly decreased (P < 0.001) in ewes’ blood plasma, by the dietary supplementation of SP.
In the monocytes of the SP5 ewes, the relative transcript levels of the TRIF (P = 0.012), MAPK (P = 0.010), and JUND (P = 0.008) genes were significantly increased compared to all the groups and the relative transcript levels of the IRF5 gene were also significantly increased (P = 0.016) compared to the CON. In neutrophils, the relative transcript levels of the MYD88 were significantly decreased (P < 0.001) in the SP10 and SP15 compared to the CON, while that of the NFKB were significantly decreased (P = 0.010) in the SP10 compared to the CON. Furthermore, the relative transcript levels of the STAT3 were also significantly decreased (P < 0.001) in the SP-fed ewes compared to the CON. In contrast, the relative transcript levels of the TRIF were significantly increased (P = 0.011) in the SP5.
In the rumen fluid, the relative abundance of Prevotella brevis was significantly increased (P = 0.001) in the SP5 and SP10, and the relative abundance of Ruminobacter amylophilus was significantly decreased (P = 0.012) in the SP10, while in the SP15 the relative abundance of Fibrobacter succinogenes and Eubacterium ruminantium was significantly increased (P = 0.008 and P = 0.005, respectively). In rumen particles, the relative abundance of Fibrobacter succinogenes in the SP5 and SP10 and of Selenomonas ruminantium in the SP5 and SP15 was significantly reduced (P = 0.017 and P = 0.001, respectively) compared to the CON. In the SP groups, the relative abundance of Ruminobacter amylophilus and Streptococcus bovis was significantly decreased (P < 0.001), while that of Ruminococcus albus was significantly increased (P = 0.046) in the SP15 compared to the CON.
Consequently, the highest supplementation level of SP (15 g/ewe/day, SP15), improved milk quality and ensured ewes’ health, as determined by the results of the milk fatty acid profile and milk oxidative stability, the ewes’ organism oxidative status, the relative expression of genes related to innate immunity and the relative abundance of the rumen microorganisms.
