Επίδραση της αζωτούχου λίπανσης και της αλατότητας στην ανάπτυξη, τη διατροφική αξία και τον πρωτογενή μεταβολισμό δύο διαφορετικών οικότυπων σταμναγκαθιού (Cichorium spinosum L.) καλλιεργούμενου υδροπονικά

Abstract

ΓΕΝΙΚΑ: Η υδροπονική καλλιέργεια του πολυετούς άγριου ραδικιού Cichorium spinosum L. που στην Ελλάδα και ιδιαίτερα στην Κρήτη παραδοσιακά ήταν ένα άγριο λαχανευόμενο είδος, γνωστό με το κοινό όνομα σταμναγκάθι, έχει αρχίσει τα τελευταία χρόνια να καλλιεργείται ως μονοετές φυτό. Στην παρούσα μελέτη, δύο εντελώς διαφορετικοί οικότυποι προερχόμενοι είτε από ορεινή (Οροπέδιο Ταύρης, Σφακιά – ορεινός οικότυπος) είτε από παραθαλάσσια περιοχή (Σταυρός Ακρωτηρίου, Χανιά – παραθαλάσσιος οικότυπος) της Κρήτης, καλλιεργήθηκαν υδροπονικά με θρεπτικό διάλυμα το οποίο περιείχε 4 ή 16 mM ολικού αζώτου σε συνδυασμό με τρεις διαφορετικές αναλογίες NH4+-N/ολικό-N (0.05, 0.25 ή 0.50) κατά τη χρονική περίοδο 2012-2014, καθώς επίσης και με τρία διαφορετικά επίπεδα αλατότητας (0.3, 20, ή 40 mM NaCl), κατά το 2015. Σκοπός των πειραμάτων ήταν να μελετηθούν τυχόν γονοτυπικές διαφορές ως προς τα αγρονομικά και ποιοτικά χαρακτηριστικά, αλλά και κατά κύριο λόγο τη μεταβολομική τους ανταπόκριση στις προαναφερόμενες πειραματικές επεμβάσεις. ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑΤΑ: Όταν τα φυτά έφτασαν στο εμπορικό στάδιο συγκομιδής τους, το ξηρό βάρος αυτών που προέρχονταν από τα ορεινά ήταν σε υψηλότερο επίπεδο από αυτό που παρατηρήθηκε για τον παραθαλάσσιο οικότυπο. Όσον αφορά τις συγκεντρώσεις των θρεπτικών στοιχείων στα φύλλα τους, αυτές ήταν γενικά υψηλότερες στην περίπτωση των παραθαλάσσιων φυτών συγκριτικά με αυτές των ορεινών και για τις δύο συγκομιδές που πραγματοποιήθηκαν. Από την άλλη πλευρά, οι συγκεντρώσεις των νιτρικών στα φύλλα σταμναγκαθιού φάνηκε να επηρεάζονται τόσο από τα επίπεδα παροχής αζώτου όσο και από τις διαφορετικές αναλογίες NH4+-N/ολικό-N και για τις δύο συγκομιδές που πραγματοποιήθηκαν. Ωστόσο τα φυτά του παραθαλάσσιου οικότυπου ήταν αυτά στα οποία παρατηρήθηκαν υψηλότερες συγκεντρώσεις νιτρικών στα φύλλα συγκρινόμενες με αυτές του ορεινού οικότυπου σε όλες τις μελετώμενες μεταχειρίσεις του πειράματος. Επιπλέον, στην περίπτωση της καταπόνησης με αλατότητα, ο παραθαλάσσιος οικότυπος φάνηκε αρκετά πιο ανθεκτικός στην παραγωγή βιομάζας καθώς επίσης περιείχε σημαντικά υψηλότερο ποσοστό νερού και μακρό- και ιχνοστοιχείων στα φύλλα ανά μονάδα ξηρού βάρους. Ωστόσο, η περιεκτικότητα του νατρίου (Na+) στο ριζικό σύστημα ήταν αξιοσημείωτα χαμηλότερη στον παραθαλάσσιο έναντι του ορεινού οικότυπου. Από την άλλη πλευρά, οι συγκεντρώσεις Na+ στα φύλλα ήταν παρόμοιες και στους δύο οικότυπους όταν η εξωτερική παροχή του NaCl ήταν πάνω από 20 mM, με τα επίπεδα όμως του ορεινού οικότυπου έναντι του παραθαλάσσιου να είναι σημαντικά υψηλότερα στη μεταχείριση με την υψηλότερη συγκέντρωση αλάτων (40 mM NaCl). Παρόλο αυτά, οι συγκεντρώσεις του Cl- ήταν αρκετά υψηλότερες στον παραθαλάσσιο οικότυπο συγκριτικά με αυτές του ορεινού σε όλες τις μεταχειρίσεις με αλατότητα. Επίσης, ο παραθαλάσσιος οικότυπος παρουσίασε μικρότερες συγκεντρώσεις τόσο στα ολικά φαινολικά οξέα, καροτενοειδή, φλαβονοειδή όσο και στα επίπεδα χλωροφύλλης συγκρινόμενος με αυτές του ορεινού οικότυπου για όλες τις εξεταζόμενες επεμβάσεις. Μελετώντας όλα τα ευρήματα, φαίνεται ότι στο μεσαίο επίπεδο αλατότητας (20 mM), η μεγαλύτερη αντοχή του παραθαλάσσιου οικότυπου συνδέεται με μηχανισμούς που μετριάζουν την τοξικότητα που προκαλούν τα ιόντα Na+ και Cl−, όπως για παράδειγμα η αραίωση των συγκεντρώσεών τους στους φυτικούς ιστούς μέσω διατήρησης υψηλότερης περιεκτικότητας νερού στα φύλλα. Σε υψηλά επίπεδα εξωτερικών συγκεντρώσεων NaCl όμως, ο αποτελεσματικός αποκλεισμός του Na+ από τους φυτικούς ιστούς των φύλλων αποτελεί έναν ακόμη μηχανισμό που προσδίδει στον παραθαλάσσιο οικότυπο του σταμναγκαθιού παραπάνω ανθεκτικότητα σε συνθήκες αλατότητας σε σύγκριση με τον ορεινό οικότυπο. Τόσο ο παραθαλάσσιος όσο και ο ορεινός οικότυπος έδειξαν να χαρακτηρίζονται από αυξημένη αποτελεσματικότητα χρήσης του Ν, καθώς η βιομάζα τους δεν φάνηκε να εμφανίζει κάποιο σημαντικό περιορισμό (μείωση) όταν η παροχή του αζώτου στο θρεπτικό διάλυμα μειώθηκε από 16 σε 4 mM. Το ποσοστό του ολικού αζώτου στα φύλλα επίσης δεν επηρεάστηκε από τις συνθήκες αλατότητας, ενώ η αλληλεπίδραση μεταξύ οικότυπου × επιπέδου ολικού-Ν ήταν μη σημαντική, αποδεικνύοντας έτσι ότι οι μηχανισμοί που εμπλέκονται στην αντοχή των φυτών στην αλατότητα διαφέρουν μεταξύ των δύο οικότυπων και δεν συνδέονται με την απορρόφηση ή την αφομοίωση του N μέσα στο φυτό. Όσον αφορά το μεταβολικό προφίλ του σταμναγκαθιού, περισσότεροι από 180 πρωτογενείς μεταβολίτες καταγράφηκαν με τους απόλυτα ή πειραματικά αναγνωρισμένους μεταβολίτες να αντιστοιχούν ποσοτικά σε περισσότερο από το 80% του μεταβολικού προφίλ. Αρκετοί από αυτούς έχουν έναν ρόλο-κλειδί στη φυσιολογία των φυτών (π.χ. τρεχαλόζη, α-λινολενικό οξύ) και είναι επίσης σημαντικοί λόγω της θρεπτικής τους αξίας (π.χ. υδατάνθρακες, αμινοξέα, λιπαρά οξέα). Τα διαφορετικά επίπεδα τόσο της παροχής αζώτου όσο και των αναλογιών NH4+-N/ολικό-N δείχνουν μια ξεκάθαρη επίδραση στον μεταβολισμό των φυτών με αρκετούς από τους πρωτογενείς μεταβολίτες όπου συμμετέχουν σε περισσότερα του ενός μεταβολικά μονοπάτια, να συντίθεται σε υψηλότερα ή χαμηλότερα επίπεδα ανάλογα και με τις επεμβάσεις. Ωστόσο, και οι δύο οικότυποι παρουσίασαν σαφείς διακρίσεις στις επεμβάσεις που πραγματοποιήθηκαν. Παρόλα αυτά, ο ορεινός οικότυπος φάνηκε να παρουσιάζει χαμηλότερα επίπεδα στην κατηγορία των υδατανθράκων (μονοσακχαρίτες) και υψηλότερα στον δισακχαρίτη τρεχαλόζη συγκριτικά με αυτά που αναπτύχθηκαν σε παράκτιες περιοχές (Σταυρός Ακρωτηρίου) όταν και οι δύο εκτίθενται σε υψηλά επίπεδα παροχής αζώτου. Από την άλλη πλευρά, οι διαφορές που παρουσιάστηκαν μεταξύ των δύο οικότυπων κάτω από συνθήκες αλατότητας εστιάζονται κυρίως στους μεταβολίτες από τον κύκλο του κιτρικού οξέος (μηλικό, φουμαρικό και ηλεκτρικό οξύ). Πιο συγκεκριμένα, διαπιστώθηκε ότι στον παραθαλάσσιο οικότυπο οι μεταβολίτες από τον κύκλο του κιτρικού οξέος επηρεάζονται πολύ λιγότερο από την αλατότητα συγκριτικά με τον ορεινό, δείχνοντας έτσι ότι τα πιο ανεκτικά στην αλατότητα φυτά είναι ικανά να εξοικονομούν ενέργεια για τις μετέπειτα φυσιολογικές τους διεργασίες. Αρκετοί γνωστοί ωσμωλύτες από την κατηγορία των αμινοξέων με πιο χαρακτηριστική την περίπτωση της προλίνης και του GABA παρουσίασαν διαφορετική ανταπόκριση κάτω από φυσιολόγικές συνθήκες παροχής αζώτου συνδυαζόμενη με υψηλές συγκεντρώσεις αλάτων. Πιο αναλυτικά, ο ορεινός οικότυπος φάνηκε να ακολουθεί πτωτική τάση στα επίπεδα των παραπάνω δύο μεταβολιτών, ενώ αντιθέτως ο παραθαλάσσιος οικότυπος ακολούθησε μια αυξητική πορεία στα επίπεδα τόσο στην περίπτωση της προλίνης όσο και του GABA. Από την άλλη πλευρά, σε χαμηλή παροχή αζώτου με υψηλή παρεχόμενη συγκέντρωση αλάτων και οι δύο οικότυποι ακολούθησαν μια ελαφρά αύξηση των επιπέδων αλλά μόνο στην περίπτωση της προλίνης. Όσον αφορά την κατηγορία των υδατανθράκων χαρακτηριστικότερα παραδείγματα όταν τα φυτά εκτίθενται σε καταπόνηση με υψηλά επίπεδα σε άλατα στο παρεχόμενο θρεπτικό διάλυμα αποτελούν η φρουκτόζη, γλυκόζη, τρεχαλόζη, μαννιτόλη και ινοσιτόλη. Πιο συγκεκριμένα, κάποιοι από αυτούς παρουσίασαν υπερέκφραση (up-regulation) με σκοπό την παραγωγή ενέργειας, όπως στην περίπτωση του παραθαλάσσιου οικότυπου αναπτυσσόμενος κάτω από διπλή αβιοτική καταπόνηση (χαμηλό άζωτο και αλατότητα) ή ακόμη στο να βοηθήσουν στην σύνθεση άλλων μεταβολιτών όπως στην περίπτωση της προλίνης. ΣΥΜΠΕΡΑΣΜΑΤΑ: Οι δύο μελετώμενοι οικότυποι σταμναγκαθιού διέφεραν σημαντικά ως προς την ανταπόκριση τους στα διαφορετικά επίπεδα θρέψης καθώς και στην περιεκτικότητα των φύλλων σε νιτρικά. Ο ορεινός οικότυπος υπερτερούσε ως προς την ανάπτυξη, την (μικρότερη) περιεκτικότητα των φύλλων σε νιτρικά και στην αντιοξειδωτική δραστηριότητα, με τον παραθαλάσσιο από την άλλη να παρουσιάζει περισσότερα θρεπτικά στοιχεία στα φύλλα και αυξημένη ανοχή στην αλατότητα. Μια χαμηλή παροχή αζώτου στο θρεπτικό διάλυμα (4 mmol L–1) σε συνδυασμό με την υψηλή αναλογία NH4+-N/ολικό-N (0,25 και πάνω) μπορεί να ελαχιστοποιήσει τις συγκεντρώσεις των νιτρικών στους φυτικούς ιστούς χωρίς να προκαλεί αρνητικές επιπτώσεις στις αποδόσεις του φυτού. Τέλος, όσον αφορά τη μελέτη του πρωτογενούς μεταβολισμού των δύο διαφορετικών άγριων οικότυπων σε συνθήκες ανάπτυξης με υψηλές συγκεντρώσεις σε άλατα, αυτή αποδεικνύει τη σαφή υπεροχή του παραθαλάσσιου οικότυπου έναντι του ορεινού οικότυπου, έχοντας ο πρώτος αναπτύξει (ή υιοθετήσει) μηχανισμούς πιο άμεσης ανταπόκρισης σε τέτοιου είδους αβιοτικές καταπονήσεις (GABA, προλίνη και καρβοξυλικά οξέα από τον TCA κύκλο).

BACKGROUND: The hydroponic cultivation of spiny chicory (Cichorium spinosum L.), also known as stamnagathi, allows the development of year-round production. In the current study, two contrasting stamnagathi ecotypes originating from a montane and a coastal-marine habitat were supplied with nutrient solution containing 4 or 16 mM total-N in combination with three different N source (NH4+-N/total-N: 0.05, 0.25 or 0.50) during the years of 2012-2014, as well as with 0.3, 20, or 40 mM NaCl at 2015. The aim was to search for genotypic differences in nitrogen nutrition and salinity stress conditions. RESULTS: At commercial maturity, the dry weight of mountainous plants was higher than that of seaside plants. The shoot mineral concentrations were higher in seaside plants than in mountainous plants in both harvests. The leaf nitrate concentration was influenced by the levels of both total-N and NH4+-N/total-N at both harvests, whereas plants with a seaside origin exhibited higher nitrate concentrations than those originating from a mountainous site in all total-N and NH4+-N/total-N treatments. Additionally, in the case of salinity stress, the coastal-marine ecotype was more salt tolerant in terms of fresh shoot biomass production and contained significantly more water and macro- and micro-nutrients in the shoot per dry weight unit. The root Na+ concentration was markedly lower in the coastal-marine compared to the montane ecotype. The leaf Na+ concentration was similar in both ecotypes at external NaCl concentrations up to 20 mM, but significantly higher in the montane compared to the coastal-marine ecotype at 40 mM NaCl. However, the leaf Cl− concentration was consistently higher in the coastal-marine than in the montane ecotype within each salinity level. The marine ecotype also contained significantly less total phenols, carotenoids, flavonoids, and chlorophyll compared to the montane ecotype across all treatments. Integrating all findings, it appears that at moderate salinity levels (20 mM), the higher salt tolerance of the coastal-marine ecotype is associated with mechanisms mitigating Na+ and Cl− toxicity within the leaf tissues, such as salt dilution imposed through increased leaf succulence. Nevertheless, at high external NaCl levels, Na+ exclusion may also contribute to enhanced salt tolerance of stamnagathi. Both ecotypes exhibited a high N-use efficiency, as their shoot biomass was not restricted when the total-N supply varied from 16 to 4 mM. The leaf organic-N was not influenced by salinity, while the interaction ecotype × N-supply-level was insignificant, indicating that the mechanisms involved in the salt tolerance difference between the two ecotypes was not linked with N-acquisition or -assimilation within the plant. With respect to the metabolic composition of stamnagathi, more than 180 metabolic features were recorded with the absolutely or tentatively identified metabolites to correspond quantitatively to more than 80% of the metabolite profiles. Many of the identified metabolites play key roles in plant physiology (e.g., trehalose, a-linolenate) and are also important for their nutritional value (e.g., carbohydrates, amino acids, fatty acids). Differences in both total-N and NH4-N/total-N levels imposed clear effects on the plant metabolism with various metabolites belonging to several biosynthetic pathways being synthesized in higher or lower levels depending on the treatments. Both ecotypes exhibited distinct responses to the treatments. Thus the montane ecotype (Sfakia) exhibiting, among others, substantially lower carbohydrate levels (monosaccharides) and higher disaccharide and a-a-trehalose levels compared to that originating from a coastal zone (Akrotiri) when both were treated with high N levels. On the other hand, the metabolic differences between the two ecotypes, which were commensurate with their different responses to salt stress, were mainly focused on the intermediates from the TCA cycle (malate, fumarate and succinate). More specifically, these metabolites were much more affected by salinity in the montane ecotype compared to that originating from a coastal-marine habitat, pointing out that salt tolerant plants are capable of saving energy for their further physiological processes. Some of the most common osmolytes from amino acids category, and especially in the case of proline and GABA, they have showed a compeletely different respond under high total-N supply combined with high salinity levels among the two contrasting ecotypes. In particular, the montane one has followed a declined trend for both metabolites above, while in contrast the seaside ecotype increased its levels, for both proline and GABA. On the other hand, at low total-N and high salinity levels both ecotypes increased the levels of proline. In the group of carbohydrates, fructose, glucose, α,α-trehalose, mannitol and myo-inositol are playing a key-role in plant’s protection under osmotic stress phenomena. In particular, some of them showed an overexpression (up-regulation), just in the case of the seaside ecotype growing under double stress conditions (low N supply combined with high salinity) in order to produce energy or to help the composition of other metabolites just like in the case of proline. CONCLUSION: The two stamnagathi ecotypes differed considerably in their responses to nitrogen nutrition and tissue nitrate content. The mountainous ecotype was superior in terms of growth, tissue nitrate concentration and antioxidant capacity, whereas the seaside ecotype accumulated more nutrient microcations in leaves. A low total-N concentration (up to 4 mmol L–1) combined with a high NH4+-N/total-N ratio (up to 0.05) could minimize tissue NO3– concentrations without compromising yield. Finally, in the case of the analysis of the primary metabolism among the two contrasting ecotypes growing under different salinity conditions indicates a completely different respond, showing that the mechanisms that have been adopted by the seaside ecotype are providing a higher tolerance under those abiotic stress conditions compared to the montane one (GABA, proline and carboxylic acids from the TCA cycle).