Απομόνωση και ταυτοποίηση ενδοφυτικών ριζοβακτηρίων από φυμάτια καλλιεργούμενων ψυχανθών και αξιολόγηση της βιολογικής δράσης τους στην ανάπτυξη των φυτών

Abstract

Τα ριζόβια έχουν ικανότητα αζωτοδέσμευσης και αφομοίωσης του αζώτου κατά τη συμβιωτική σχέση που αναπτύσσουν με ψυχανθή φυτά, στα οποία σχηματίζουν ριζικά φυμάτια. Εκτός από ριζόβια, στα φυμάτια εντοπίζονται επιπλέον μη φυματιογενή ενδοφυτικά ριζοβακτήρια, τα οποία προωθούν την ανάπτυξη των φυτών καθώς και την αντοχή σε αβιοτικές και βιοτικές καταπονήσεις και ορισμένα απ’ αυτά έχουν αξιοποιηθεί εμπορικά. Τα τελευταία χρόνια υπάρχει έντονη ερευνητική δραστηριότητα τόσο για τα ριζόβια όσο και για τα ενδοφυτικά ριζοβακτήρια γιατί αποτελούν αναπόσπαστο κομμάτι της βιώσιμης γεωργίας. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή απομονώθηκαν 166 ριζόβια και 38 ενδοφυτικά ριζοβακτήρια από φυμάτια καλλιεργούμενων [κουκί (Vicia faba), φασόλι (Phaseolus vulgaris, Phaseoli coccineus) και άγριων ψυχανθών [φτερωτό μπιζέλι (Tetragonolobus purpureus), έβενος (Ebenus cretica)], από διαφορετικές περιοχές της ηπειρωτικής και νησιωτικής Ελλάδας. Η μελέτη της γενετικής ετερογένειας των ριζοβίων επέτρεψε τη διάκριση τους σε συνολικά 33 αντιπροσωπευτικά στελέχη ριζοβίων προερχόμενα από το κουκί, τη φασολιά και το φτερωτό μπιζέλι τα οποία μελετήθηκαν περαιτέρω. Η ταυτοποίηση των απομονώσεων σε επίπεδο γένους ή/ και είδους βασίστηκε στη φυλογενετική ανάλυση ευρέως χρησιμοποιούμενων γονιδίων π.χ. 16S rRNA, recA, glnII, gyrB, κ.α. Η ταξινομική θέση των απομονωμένων ριζοβίων σε επίπεδο συμβιότυπου καθορίστηκε από τη φυλογένεια γονιδίων που σχετίζονται με τη συμβίωση, όπως τα γονίδια nifH και nodC. Τα ριζόβια από το κουκί ταξινομήθηκαν ως Rhizobium hidalgonense με τη συντριπτική πλειοψηφία να ανήκουν στα γονιδιωματικά είδη gsF-2, gsB και gsA του Rhizobium leguminosarum species complex καθώς και των Rhizobium laguerreae και Rhizobium ruizarguesonis. Το Rhizobium VFEP82 το οποίο είναι φυλογενετικά πλησιέστερο στο Rhizobium grahamii, κατά πάσα πιθανότητα ανήκει σε μια νέα γενεαλογική σειρά. Με εξαίρεση την απομόνωση VFEP82 όπου δεν κατέστη εφικτή η ενίσχυση του γονιδίου nodC, οι υπόλοιπες απομονώσεις ταξινομήθηκαν στο συμβιότυπο viciae και προσδιορίστηκαν τέσσερις απλότυποι του γονιδίου nodC (A – D). Ένα σημαντικό εύρημα ήταν ο εντοπισμός του συμβιότυπου viciae σε στελέχη Rhizobium hidalgonense (VFEP162), καθώς αυτό αναφέρθηκε για πρώτη φορά. Στην περίπτωση των ριζοβίων της φασολιάς, οι απομονώσεις ταξινομήθηκαν σε καλά καθορισμένα είδη των Rhizobium redzepovicii, Rhizobium hidalgonense, Rhizobium anhuiense, Rhizobium croatiense, Rhizobium sophoriradicis, Rhizobium azibense, Rhizobium tropici. Εξαίρεση αποτέλεσε ένα πλήθος ριζοβίων με αντιπροσωπευτικό στέλεχος το PVKV3, που αν και είναι φυλογενετικά πλησιέστερο στο Rhizobium etli, κατά πάσα πιθανότητα συνιστά νέα γενεαλογική σειρά. Τα περισσότερα από τα ριζόβια φασολιάς ταξινομήθηκαν στο συμβιότυπο phaseoli και έφεραν τα αλληλόμορφα α-, γ-a και γ-b του γονιδίου nodC. Ο συμβιότυπος των υπολοίπων προσδιορίστηκε ως sv gallicum και tropici. Επιπλέον σημαντικό εύρημα ήταν η καταγραφή στελέχους Rhizobium sophoriradicis με αλληλόμορφο γ-b καθώς κάτι τέτοιο δεν έχει αναφερθεί ξανά σε ευρωπαϊκά εδάφη. Τα ριζόβια του φτερωτού μπιζελιού ομαδοποιήθηκαν μαζί με τα Mesorhizobium ciceri και εμφάνισαν τον συμβιότυπο biserrulae. Επιπλέον, η ταυτοποίηση των μη φυματιογενών ενδοφυτικών ριζοβακτηρίων των φυματίων κατέταξε τις 38 απομονώσεις ως Enterobacter sp., Bacillus sp., Ochrobactrum sp, Shinella spp, Pseudomonas spp, Achromobacter sp., Microbacterium spp., Georgenia sp., Kocuria spp., Roseomonas sp., Sphingomonas sp. και Phyllobacterium sp. Ο έλεγχος της ικανότητας των ριζοβίων του κουκιού και της φασολιάς να μολύνουν τον ξενιστή από τον οποίο προήλθαν, επιβεβαίωσε ότι είναι πραγματικοί μικροσυμβιώτες για τα φυτά αυτά. Η αξιολόγηση της ικανότητας προώθησης της ανάπτυξης του κουκιού μετά από εμβολιασμό του σπόρου με στελέχη Rhizobium έδειξε ότι το στέλεχος VFLE1 συνέβαλε στην αύξηση του μήκους και της ξηρής βιομάζας του βλαστού των φυτών, ενώ ο μέγιστος αριθμός φυματίων παρατηρήθηκε σε φυτά εμβολιασμένα με το VFEP162. Xαρακτηριστικά γνωρίσματα που σχετίζονται με την προώθηση της ανάπτυξης των φυτών εξετάστηκαν σε αντιπροσωπευτικά στελέχη ριζοβίων κουκιού, φασολιάς και φτερωτού μπιζελιού καθώς και σε επιλεγμένα ενδοφυτικά ριζοβακτήρια Enterobacter VFAT314 και Bacillus VFFN21 που απομονώθηκαν στην παρούσα διατριβή. Παρόμοια ανάλυση έγινε σε ριζόβια και ενδοφυτικά ριζοβακτήρια που είχαν απομονωθεί σε προγενέστερο χρόνο, όπως τα Bradyrhizobium spp (VUCR24, VUEP21, VULI11), Ensifer sp. VUKA2, Enterobacter spp (C1.2, C1.5, C3.1) και Lelliottia sp. D2.4. Όλα τα στελέχη που εξετάστηκαν είχαν ικανότητα διαλυτοποίησης του φωσφόρου και παραγωγής σιδηροφόρων. Ικανότητα παραγωγής αυξίνης καταγράφηκε μόνο στα Rhizobium, στα Bradyrhizobium, VUCR24 και VULI11, και στο Enterobacter sp. VFAT314. Ικανότητα παραγωγής βιοεπιφανειοδραστικών ενώσεων καταγράφηκε μόνο στο Bradyrhizobium VUEP21 και στο Bacillus VFFN21. Η μελέτη της ικανότητας επιβίωσης των επιλεγμένων ριζοβακτηρίων σε αβιοτικές συνθήκες καταπόνησης (θερμοκρασία, αλατότητα pH, υδατική καταπόνηση), έδειξε διαφορετικό αβιοτικό προφίλ ανοχής μεταξύ των εξεταζομένων γενών. Τα ριζόβια και ο Bacillus VFFN21 ήταν τα πιο ευαίσθητα σε αυτές τις καταπονήσεις με διαφοροποιήσεις αναλόγως της εξεταζόμενης βιοδοκιμασίας, ενώ τα Enterobacter και η Lelliottia D2.4 ξεχώρισαν για την ανοχή τους στις περισσότερες συνθήκες αβιοτικής καταπόνησης. Η μελέτη της ανταγωνιστικότητας των εξεταζομένων ριζοβακτηρίων έναντι τεσσάρων φυτοπαθογόνων μυκήτων Alternaria alternata, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum, Verticillium dahliae και 14 βακτηρίων Pseudomonas syringae (3), Dickeya solani, Acidovorax citrulli (3), Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, Pectobacterium brasiliense (2), και Clavibacter (3) ανέδειξε τα Enterobacter, Lelliottia D2.4 και Bacillus VFFN21 ως βιολογικούς παράγοντες ελέγχου (Β.Π.Ε.). Από τα ριζόβια μόνο το Bradyrhizobium VULI11 εμφάνισε παρεμποδιστική δάση κατά των Clavibacter. Τα Enterobacter, Lelliottia D2.4 και Bacillus VFFN21 χρησιμοποιήθηκαν ως εμβολιαστικό υλικό σε μη ψυχανθή φυτά. Η μελέτη προώθησης της ανάπτυξης φυτών τομάτας μετά από εφαρμογή των παραπάνω ενδοφυτικών ριζοβακτηρίων έδειξε ότι φυτά εμβολιασμένα με το στέλεχος D2.4 είχαν μεγαλύτερη νωπή και ξηρή βιομάζα βλαστού και περισσότερη ξηρή βιομάζα ρίζας. Επιπλέoν, η δράση του D2.4 ήταν ωφέλιμη στην ανάπτυξη φυτών τομάτας που ήταν μολυσμένα με Clavibacter και στο μετριασμό των συμπτωμάτων της ασθένειας. Φυτά εμβολιασμένα με το στέλεχος Enterobacter VFAT314 είχαν μεγαλύτερο μήκος, νωπή και ξηρή βιομάζα και ήταν περισσότερο υγιή σε σχέση με τα φυτά που είτε είχαν εμβολιαστεί με τους υπόλοιπους Β.Π.Ε., είτε όχι. Η αξιολόγηση της βιολογικής προστασίας κονδύλων πατάτας και καρότου από το φυτοπαθογόνο D. solani IPO 2222 έδειξε ότι η εφαρμογή των παραπάνω Β.Π.Ε. δεν παρεμπόδισε την πρόκληση μαλακής σήψης, παρότι in vitro λειτούργησαν ανταγωνιστικά. Η εφαρμογή των Β.Π.Ε. σε φυτά τομάτας και μελιτζάνας για βιολογική προστασία από το φυτοπαθογόνο μύκητα Botrytis cinerea, ανέδειξε τα βακτήρια Enterobacter C1.5 και το Enterobacter C1.2 που λειτούργησαν φυτοπροστατευτικά. Σε φυτά τομάτας και μελιτζάνας εμβολιασμένα με το C1.5 και το C1.2, αντίστοιχα, η θνησιγόνος και μολυσματική δράση του μύκητα ήταν μικρότερη. Η παρούσα μελέτη συνέβαλε στη δημιουργία συλλογής βιολογικού υλικού με ριζοβακτήρια (ριζόβια και ενδοφυτικά ριζοβακτήρια) που εν δυνάμει προωθούν την ανάπτυξη των φυτών και έχουν φυτοπροστατευτική δράση. Οι μικροοργανισμοί αυτοί θα μπορούσαν να χρησιμοποιηθούν για την ανάπτυξη βιοδιεγερτών και να εφαρμοστούν μελλοντικά σε συστήματα βιολογικής γεωργίας.

Rhizobia have the ability to fix and assimilate nitrogen after establishing symbiotic relationship with leguminous plants, forming root nodules. Apart from rhizobia, nodules harbor non-nodulating endophytic rhizobacteria, which promote plant growth, enhance resistance to abiotic and biotic stresses and some of them have been used commercially. In recent years, there has been intense research activity for both rhizobial and endophytic rhizobacteria because they are an integral part of sustainable agriculture. In this thesis, 166 rhizobia and 38 endophytic rhizobacteria were isolated from nodules of cultivated [faba bean (Vicia faba), bean (Phaseolus vulgaris, Phaseoli coccineus) and wild endemics legumes [winged pea (Tetragonolobus purpureus), ebony (Ebenus cretica)], from different regions of Greece. The study of genetic heterogeneity of rhizobia allowed them to be distinguished into a total of 33 representative rhizobia from broad bean, bean and winged pea which were further analysed. The identification of isolates to genus and/or species level was based on phylogenetic analysis of widely used genes e.g. 16S rRNA, recA, glnII, gyrB, etc. The taxonomic position of the isolated rhizobia at the symbiovar level was determined by the phylogeny of symbiotic-related genes such as nifH and nodC. Rhizobia from faba bean were classified as Rhizobium hidalgonense with the vast majority belonging to genospecies gsF-2, gsB and gsA of the Rhizobium leguminosarum complex, Rhizobium laguerreae and Rhizobium ruizarguesonis. Rhizobium sp. VFEP82 which is phylogenetically closer to Rhizobium grahamii, belongs presumably to a new rhizobial lineage. With the exception of Rhizobium VFEP82 where the nodC gene was not amplified, the remaining isolates belonged to symbiovar (sv.) viciae harboring four distinct nodC gene haplotypes (A – D). An important finding was the identification of sv. viciae symbiotype in Rhizobium hidalgonense (VFEP162), which is reported for the first time. In case of common bean rhizobia, the strains were closely related to Rhizobium redzepovicii, Rhizobium hidalgonense, Rhizobium anhuiense, Rhizobium croatiense, Rhizobium sophoriradicis, Rhizobium azibense and Rhizobium tropici. Interesting was the case of rhizobia with the representative strain PVKV3, which is phylogenetically closer to Rhizobium etli, but probably belongs to belong to a new rhizobial lineage. Most strains belonged to symbiovar phaseoli carrying the α-, γ-a and γ-b alleles of nodC gene, while some of them belonged to symbiovar gallicum and tropici. To the best of our knowledge, it is the first time that strains assigned to R. sophoriradicis and harbored the γ-b allele were found in European soils. Winged pea rhizobia were grouped together with Mesorhizobium ciceri and belonged to symbiovar (sv.) biserrulae. In addition, the identification of non –nodulating endophytic rhizobacteria classified them as Enterobacter sp., Bacillus sp., Ochrobactrum sp, Shinella spp, Pseudomonas spp, Achromobacter sp., Microbacterium spp., Georgenia sp., Kocuria spp., Roseomonas sp., Sphingomonas sp. and Phyllobacterium sp. Nodulation test between rhizobia isolated from faba bean and common bean and the host of origin, confirmed that they are true microsymbionts for them. The evaluation of the ability to promote the growth of faba bean after inoculation of the seed with Rhizobium strains showed that strain VFLE1 contributed to increase in plant shoot length and dry biomass, while the maximum number of nodules was observed in plants inoculated with VFEP162. Characteristic traits related to plant growth promotion were examined in representative rhizobia strains of faba bean, common bean, winged pea and in the selected endophytic rhizobacteria Enterobacter VFAT314 and Bacillus VFFN21 which were isolated in this thesis. Similar analysis was performed to examine rhizobia and endophytic rhizobacteria that had been isolated at an earlier time, such us Bradyrhizobium spp (VUCR24, VUEP21, VULI11), Ensifer sp. VUKA2, Enterobacter spp (C1.2,C1.5, C3.1) and Lelliottia sp. D2.4. All strains had the ability to solubilize phosphorus and produce siderophore. Rhizobium, Bradyrhizobium VUCR24, VULI11 and Enterobacter VFAT314 were able to produce auxin, while Bradyrhizobium VUEP21 and Bacillus VFFN21 produced biosurfactant compounds. Testing survival ability of the selected rhizobacteria under extreme growth conditions (temperature, pH salinity, water stress) showed different abiotic tolerance profile between the genera. Rhizobia and Bacillus VFFN21 were the most sensitive to extreme growth conditions, while Enterobacter and Lelliottia D2.4 stood out for their tolerance to most stress conditions. Enterobacter, Lelliottia D2.4 and Bacillus VFFN21 were tested successfully in most cases against four phytopathogenic fungi (Alternaria alternate, Botrytis cinerea, Fusarium oxysporum f. sp. radicis-cucumerinum, Verticillium dahlia) and 14 bacteria [Pseudomonas syringae (3), Dickeya solani, Acidovorax citrulli (3), Xanthomonas campestris, Erwinia amylovora, Pectobacterium brasiliense (2), Clavibacter (3)]. For that reason, they were characterized as biological control agents (BCA). From rhizobia, only Bradyrhizobium VULI11 showed inhibitory action against Clavibacter. Enterobacter, Lelliottia D2.4 και Bacillus VFFN21 were used as inoculants in non-legumes plants. Tomato plants inoculated with D2.4 exhibited greater shoot fresh and dry biomass and more root dry biomass. Moreover, Lelliottia D2.4 exhibited plant growth promotion ability in tomato plants infected with Clavibacter and alleviated disease symptoms. Plants inoculated with Enterobacter VFAT314 had greater length, fresh and dry biomass, and were healthier compared to plants which either had been inoculated with the rest of BCA, or not. The evaluation of biological protection of potato and carrot pieces from the phytopathogen D. solani IPO 2222 showed that the above BCA did not prevent the induction of soft rot, although in vitro they exhibited in vitro antagonistic activity. Tests aiming to detect biological control efficiency against Botrytis cinerea in tomatoes and eggplants revealed that the most effective BCA were Enterobacter C1.5 and Enterobacter C1.2, reducing the mortality rate and disease severity of infected tomatoes and eggplants, respectively. The present study contributed to the creation of a collection of biological material with potential rhizobacteria (rhizobial and endophytic rhizobacteria) that promote plant growth and have phytoprotective action. These microorganisms could be used for the development of biostimulants based on BCA which could be applied in the future in organic farming systems.