Διερεύνηση της εφαρμογής της φασματοσκοπίας ανάκλασης εγγύς υπερύθρου στην πρόβλεψη της διαιτητικής αξίας σύνθετων ζωοτροφών σε κόνικλους

Abstract

Ο προσδιορισμός της πεπτικότητας έχει ρόλο κλειδί στη διαιτητική εκτίμηση των ζωοτροφών, αλλά λόγω κόστους και χρόνου των κλασικών μεθόδων δεν μπορεί να πραγματοποιηθεί σε πραγματικό χρόνο, όπου και έχει ιδιαίτερη σημασία. Η φασματοσκοπία ανάκλασης εγγύς υπερύθρου (NIRS) μπορεί να προβλέψει την πεπτικότητα σε πραγματικό χρόνο, χρησιμοποιώντας χημειομετρικούς αλγόριθμους, που συσχετίζουν ποσοτικά τα φασματικά και αναλυτικά δεδομένα ζωοτροφών και κόπρου (εξισώσεις βαθμονόμησης). Η ακρίβεια όμως των προβλέψεων με τη σημερινή μεθοδολογία περιορίζει τις δυνατότητες της NIRS σε αδρές κατά κανόνα εκτιμήσεις της πεπτικότητας. Η παρούσα διδακτορική διατριβή, χρησιμοποιώντας τον κόνικλο ως ζώο αναφοράς, είχε ως στόχο τη βελτίωση της ακρίβειας πρόβλεψης της πεπτικότητας στη NIRS με δύο τρόπους: α) την ανάπτυξη και αξιολόγηση μίας υβριδικής προσέγγισης συνδυασμού των φασματικών δεδομένων κόπρου και τροφής, χρησιμοποιώντας έναν άπεπτο δείκτη (φυτογενές πυρίτιο – PS) ως συνδετικό κρίκο και β) την αξιολόγηση της χρήσης τεχνητών νευρωνικών δικτύων στη δημιουργία ισχυρών προγνωστικών μοντέλων πρόβλεψης της πεπτικότητας. Έτσι, η πρώτη υπόθεση που εξετάστηκε ήταν αν το PS θα μπορούσε να χρησιμεύσει ως εσωτερικός δείκτης για τον υπολογισμό της πεπτικότητας στους κονίκλους διερευνώντας την ανάκτηση στην κόπρο (για να προσδιοριστεί αν είναι 100% άπεπτο) και την ευκολία ακριβούς ποσοτικοποίησης χρησιμοποιώντας απλές και αξιόπιστες μεθόδους σε πολύ μεγάλο αριθμό δειγμάτων και σε σύντομο χρονικό διάστημα. Η δεύτερη υπόθεση που διερευνήθηκε ήταν αν μπορεί να πραγματοποιηθεί ανάπτυξη χημειομετρικών μοντέλων NIRS για τον ποσοτικό προσδιορισμό του PS μαζί με τα κύρια θρεπτικά συστατικά (ΞΟ, OΟ, ΑΟ, κ.λπ.), σε τροφές και κόπρο ώστε να αξιολογηθεί η δυνατότητα εφαρμογής μίας υβριδικής προσέγγισης υπολογισμού της πεπτικότητας με βάση τα χημικά χαρακτηριστικά των ζωοτροφών και της κόπρου και αποκλείοντας κάθε φυσική πληροφορία των φασματικών δεδομένων, που θα μπορούσε ενδεχομένως να επηρεάσει αρνητικά τις προβλέψεις της πεπτικότητας. Στην εξέταση διερευνήθηκε και η δυνατότητα χρήσης τεχνητών νευρωνικών δικτύων για την ανάπτυξη βέλτιστων μοντέλων πρόβλεψης της πεπτικότητας χρησιμοποιώντας μόνο τα φασματικά δεδομένα της κόπρου (που περιέχουν και φυσικές πληροφορίες). Η τρίτη υπόθεση που εξετάστηκε στην παρούσα διατριβή ήταν εάν και σε ποιο βαθμό μπορούν να αξιοποιηθούν τα σύγχρονα χαρακτηριστικά της NIRS ώστε να διαπιστωθεί αν η προτεινόμενη μεθοδολογία μπορεί να εφαρμοστεί σε πρακτικές συνθήκες σε διάφορες μορφές δειγμάτων (νωπά, μη αλεσμένα, αποξηραμένα κ.ο.κ). Στο πλαίσιο αυτό εξετάστηκε πάλι η χρήση τεχνητών νευρωνικών δικτύων ώστε να διερευνηθεί αν και κατά πόσο μπορούν να βελτιώσουν την προγνωστική ισχύ των μοντέλων της NIRS, όταν αυτά βασίζονται σε μη προετοιμασμένα δείγματα. Για τη διερεύνηση της πρώτης υπόθεσης χρησιμοποιήθηκαν τριάντα δείγματα κόπρου από προηγούμενη μελέτη για τον υπολογισμό του συντελεστή φαινόμενης πεπτικότητας (ΣΦΠ) της ξηράς ουσίας (ΞΟ) και της συνόλης ενέργειας (ΣΕ) του ίδιου βασικού σιτηρεσίου σύμφωνα με την ευρωπαϊκή μέθοδο αναφοράς (European Reference Method, ERM), την τεχνική της ΑΙΑ και την εξεταζόμενη τεχνική PS (n = 10 κόνικλοι/μέθοδο). Το PS είναι το κύριο κλάσμα της αδιάλυτης στο υδροχλωρικό οξύ τέφρας (AIA), η οποία χρησιμοποιείται ως εσωτερικός δείκτης στον προσδιορισμό της πεπτικότητας. Ωστόσο, σε σύγκριση με την ΑΙΑ, το PS μπορεί να ποσοτικοποιηθεί με μεθόδους περισσότερο ταχείες και ευαίσθητες. Ως εκ τούτου, το παρόν πείραμα είχε ως στόχο να αξιολογήσει το PS ως εναλλακτικό της AIA δείκτη για τον υπολογισμό της πεπτικότητας σε κόνικλους. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι οι συγκεντρώσεις της ΑΙΑ στην τροφή και την κόπρο ήταν 12,89 ± 0,066 και 31,58 ± 0,042 g/kg, ενώ εκείνες του PS ήταν 13,98 ± 0,066 και 36,59 ± 0,059 g/kg, αντίστοιχα (μέσος όρος ± SEM). Η ανάκτηση του δείκτη ήταν 100,3 ± 1,43 % και 100,8 ± 1,48 % για την AIA και την PS (P= 0,939) τεχνική, αντίστοιχα. Ο ΣΦΠ της ΞΟ δεν διέφερε μεταξύ των μεθόδων (P= 0,935) και ήταν 0,589 ± 0,0055, 0,591 ± 0,0056 και 0,588 ± 0,0060 για τις ERM, AIA και PS, αντίστοιχα. Επίσης, ο ΣΦΠ της ΣΕ ήταν παρόμοιος μεταξύ όλων των μεθόδων (P = 0,914) και ήταν 0,581 ± 0,0058, 0,585 ± 0,0060 και 0,584 ± 0,0064 για τις ERM, AIA και PS, αντίστοιχα. Ο προσδιορισμός του PS απαιτούσε πολύ μικρότερη ποσότητα δείγματος (κατά 98 %) και όγκους αντιδραστηρίων (κατά 68–82 %) και επέτρεψε την ανάλυση περισσοτέρων δειγμάτων (κατά 7 φορές περισσότερα) σε σύγκριση με την ΑΙΑ. Συμπερασματικά, το PS αξιολογήθηκε ως ένας αξιόπιστος εσωτερικός δείκτης που προσφέρει τη δυνατότητα υπολογισμού του ΣΦΠ με την ίδια ακρίβεια με τη μέθοδο αναφοράς στους κόνικλους. Για την εξέταση της δεύτερης και τρίτης υπόθεσης της παρούσας διατριβής χρησιμοποιήθηκαν συνολικά 27 δείγματα τροφής και 282 δείγματα κόπρου από in vivo πείραμα πεπτικότητας σε κονίκλους. Επιπλέον, συλλέχθηκαν 43 δείγματα ζωοτροφών από εμπορικές μονάδες για την επέκταση του συνόλου των δεδομένων. Κάθε σύνολο δεδομένων χωρίστηκε τυχαία σε σύνολα βαθμονόμησης και επικύρωσης. Πρώτον, αναπτύχθηκαν βαθμονομήσεις για την πρόβλεψη της χημικής σύστασης των ζωοτροφών και της κόπρου, συμπεριλαμβανομένου του PS. Τα δείγματα της τροφής εξετάστηκαν σε δύο μορφές (ακέραια σύμπηκτα, αλεσμένα σύμπηκτα), ενώ της κόπρου εξετάστηκαν σε τρεις μορφές (νωπά μη αλεσμένα, αποξηραμένα μη αλεσμένα και αποξηραμένα αλεσμένα). Τα φάσματα κόπρου χρησιμοποιήθηκαν για την πρόβλεψη του ΣΦΠ της ξηράς ουσίας (ΞΟ), της οργανικής ουσίας (ΟΟ) και των ολικών αζωτούχων ουσιών (ΟΑ). Οι βαθμονομήσεις αξιολογήθηκαν α) εσωτερικά με διασταυρούμενη επικύρωση, χρησιμοποιώντας τη μέθοδο ελέγχου ένα τη φορά (leave-one-out) για την τροφή και τη μέθοδο ελέγχου ανά ομάδα (k-fold) για την κόπρο και β) εξωτερικά με ένα ανεξάρτητο σετ. Επιπλέον, αναπτύχθηκαν με τεχνητά νευρωνικά δίκτυα (ΑΝΝ), μοντέλα εμπρόσθιας διάδοσης για τα δείγματα κόπρου στις τρείς προαναφερόμενες μορφές με σκοπό την αξιολόγηση πρόβλεψης της πεπτικότητας της ΞΟ, της ΟΟ και των ΟΑ χρησιμοποιώντας μόνο τα φασματικά δεδομένα της κόπρου. Οι περισσότερες χημικές παράμετροι των ζωοτροφών προβλέφθηκαν με ακρίβεια (R2val > 0,8), αλλά μόνο στα αλεσμένα δείγματα. Η ανάλυση των μη αλεσμένων δειγμάτων έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα μόνο για την ΞΟ και τις ΟΑ (R2val = 0,80 και R2val = 0,88, αντίστοιχα). Οι χημικές παράμετροι της κόπρου προβλέφθηκαν με ακρίβεια, μόνο για την ΞΟ και τις ΟΑ (R2val = 0,89 και R2val = 0,88, αντίστοιχα) στη νωπή κόπρο. Η ανάλυση των αποξηραμένων αλεσμένων δειγμάτων κόπρου έδωσε ικανοποιητικά αποτελέσματα μόνο για τις ΟΑ (R2val = 0,92). Όσον αφορά τον δείκτη PS, προβλέφθηκε στην τροφή με ακρίβεια στο ανεξάρτητο σύνολο (R2val = 0,75) και με μικρότερη ακρίβεια, αλλά σχετικά ικανοποιητικά στην κόπρο (R2val = 0,70). Η πρόβλεψη του ΣΦΠ των θρεπτικών συστατικών από τα φάσματα της κόπρου είχε σχετικά καλή τιμή (R2val > 0,75), αλλά μόνο για τα αποξηραμένα και αλεσμένα δείγματα. Αντίθετα, η χρήση των τεχνητών νευρωνικών δικτύων (ΑΝΝ) βελτίωσε σημαντικά την προγνωστική ισχύ των μοντέλων τόσο στα νωπά (ακέραια σφαιρίδια κόπρου) όσο και στα αποξηραμένα ολόκληρα δείγματα, γεγονός που ήταν ιδιαίτερα εμφανές για το μοντέλο που προέβλεπε την πεπτικότητα των ΟΑ (R2val> 0,91). Το επόμενο βήμα ήταν ο υπολογισμός των ΣΦΠ των θρεπτικών συστατικών και στη συνέχεια η σύγκριση με τη μέθοδο ολικής συλλογής και την έμμεση NIRS (όπου προβλέφθηκαν οι ΣΦΠ με χρήση των φασματικών δεδομένων της κόπρου μόνο). Τα μοντέλα NIRS έδειξαν ακριβή πρόβλεψη του δείκτη PS και η σύγκριση των υπολογισμένων ΣΦΠ με αυτούς της μεθόδου αναφοράς δεν έδειξε σημαντικές διαφορές. Συμπερασματικά, η υβριδική προσέγγισή μπορεί να υπολογίσει με ακρίβεια το ΣΦΠ των θρεπτικών ουσιών και επιπλέον, βασίζεται μόνο στις χημικές πληροφορίες και όχι σε οποιαδήποτε φυσική ιδιότητα των τροφών και της κόπρου, η οποία μπορεί να επηρεάσει ενδεχομένως αρνητικά την πρόβλεψη της πεπτικότητας. Επιπλέον, η χρήση των ΑΝΝ μπορεί να βελτιώσει την ισχύ των μοντέλων πρόβλεψης της πεπτικότητας, ειδικά σε μη προετοιμασμένα δείγματα (νωπά μη αλεσμένα), κάτι που είναι ιδιαίτερης πρακτικής σημασίας. Τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, ακολουθούνται από κάποιους περιορισμούς που πρέπει να ληφθούν υπόψιν. Αρχικά, τα μοντέλα που αναπτύχθηκαν αφορούν τα συγκεκριμένα δείγματα που χρησιμοποιήθηκαν για βαθμονόμηση/επικύρωση, οπότε η χρήση των μοντέλων πέραν αυτών των δειγμάτων, δηλαδή σε μελλοντικά άγνωστα δείγματα, πιθανόν να μη δώσει παρόμοια αποτελέσματα. Για την ευρεία εφαρμογή των μοντέλων απαιτείται και διεύρυνση των ομάδων βαθμονόμησης. Όπως παρατηρήθηκε σε κάποιες από τις εξεταζόμενες παραμέτρους, τα μη ικανοποιητικά αποτελέσματα από τις ομάδες επικύρωσης, παρά τα πολύ καλά στατιστικά στις ομάδες βαθμονόμησης, δείχνουν ότι απαιτείται η διεύρυνση των δειγμάτων ώστε να αυξηθεί η παραλλακτικότητα της υπό εξέταση παραμέτρου.

The determination of digestibility has a key role in the nutritive evaluation of animal feed, but due to the cost and time of the classical determination methods it cannot be performed in real time, where it is of particular importance. Near-infrared reflectance spectroscopy (NIRS) can predict digestibility in real time, using chemometric algorithms, which quantitatively correlate feed and fecal spectral and analytical data (calibration equations). However, the accuracy of the predictions with the current methodology limits the possibilities of NIRS to generally rough estimates of digestibility. The present doctoral thesis, using the rabbit as a reference animal, aimed to improve the digestibility prediction accuracy in NIRS by: a) developing and evaluating a hybrid approach which combines fecal and feed spectral data, using an indigestible marker (phytogenic silica – PS) as a connecting link and b) evaluating the use of artificial neural networks (ANN) in the development of robust predictive models for predicting digestibility. Thus, the first hypothesis examined was whether PS could serve as an internal indigestible marker to calculate digestibility in rabbits by investigating its fecal recovery (to determine if it is 100% indigestible) and the ease of accurate quantification using simple and reliable methods in a very large number of samples and in a short time. The second hypothesis investigated was whether development of NIRS chemometric models for the quantification of PS along with major nutrients (XO, OO, AO, etc.) can be carried out in feed and feces to assess the applicability of a hybrid approach for calculating digestibility based on the chemical characteristics of feed and feces and excluding any physical information of the spectral data, which might negatively affect digestibility predictions. The examination also explored the possibility of using ANN to develop optimal digestibility prediction models using only the fecal spectral data (which also contain physical information). The third hypothesis examined in this thesis was whether and to what extent the modern features of NIRS can be utilized in order to decide if the proposed methodology can be applied in practical conditions to various types of samples (fresh, unground, dried, etc.). K). In this context, the use of artificial neural networks was again examined to investigate whether and to what extent they can improve the predictive power of NIRS models on unprepared fecal samples. To investigate the first hypothesis, thirty fecal samples from a previous study were used to calculate the coefficient of total tract apparent digestibility (CTTAD) of the dry matter (DM) and the gross energy (GE) of the same basic diet according to the European Reference Method (ERM), the AIA technique and the examined PS technique (n = 10 rabbits/method). PS is the major fraction of hydrochloric acid-insoluble ash (AIA), which is used as an internal marker in the determination of digestibility. However, compared to AIA, PS can be quantified by more rapid and sensitive methods. Therefore, the present experiment aimed to evaluate PS as an alternative marker to AIA for the calculation of digestibility in rabbits. The results showed that the concentrations of AIA in feed and feces were 12.89 ± 0.066 and 31.58 ± 0.042 g/kg, while those of PS were 13.98 ± 0.066 and 36.59 ± 0.059 g/kg, respectively (mean ± SEM). Fecal marker recovery was 100.3 ± 1.43 % and 100.8 ± 1.48 % for AIA and PS (P= 0.939) technique, respectively. The CTTAD of DM did not differ between methods (P= 0.935) and was 0.589 ± 0.0055, 0.591 ± 0.0056 and 0.588 ± 0.0060 for ERM, AIA and PS, respectively. Also, the CTTAD of GE was similar between all methods (P= 0.914) and was 0.581 ± 0.0058, 0.585 ± 0.0060, and 0.584 ± 0.0064 for ERM, AIA, and PS, respectively. PS determination required much less sample amount (by 98 %) and reagent volumes (by 68–82 %) and allowed the analysis of more samples (7-fold greater) compared to AIA. In conclusion, PS was evaluated as a reliable internal marker that offers the possibility to calculate the digestibility with the same accuracy as the reference method in rabbits. To examine the second and third hypotheses of this thesis, a total of 27 feed samples and 282 feecal samples from an in vivo digestibility experiment in rabbits were used. In addition, 43 feed samples were collected from commercial units to expand the data set. Each data set was randomly divided into calibration and validation sets. First, calibrations were developed to predict the chemical composition of feed and manure, including PS. The feed samples were examined in two forms (intact pellets, ground pellets), while the fecal samples were examined in three forms (fresh unground, dried unground and dried ground). Fecal spectra were used to predict the CTTAD of DM, organic matter (OM) and crude protein (CP). Calibrations were assessed a) internally by cross-validation using the leave-one-out method for feed and the k fold method for feces and b) externally with an independent set. In addition, forward propagation models were developed with artificial neural networks (ANNs) for the fecal samples in the three aforementioned forms in order to evaluate the prediction of the digestibility of DM, OM and CP using only the fecal spectral data. Most feed chemical parameters were accurately predicted (R2val > 0.8), but only in the ground samples. The analysis of the unground samples gave satisfactory results only for ΞO and OA (R2val = 0.80 and R2val = 0.88, respectively). Feces’ chemical parameters were accurately predicted, only for DM and CP (R2val = 0.89 and R2val = 0.88, respectively) in fresh feces. The analysis of dried ground fecal samples gave satisfactory results only for CP (R2val = 0.92). Regarding the PS marker, it was predicted in the feed accurately in the independent set (R2val = 0.75) and less accurately, but relatively satisfactorily in feces (R2val = 0.70). The prediction of nutrient digestibility using fecal spectra had a relatively good value (R2val > 0.75), but only for the dried and ground samples. On the contrary, the use of artificial neural networks (ANN) significantly improved the predictive power of the models both in fresh (intact fecal pellets) and dried intact fecal samples, which was particularly evident for the model predicting the digestibility of CP (R2val > 0 .91). The next step was to calculate the nutrient digestibility and then compare with the total collection method and indirect NIRS (where digestibility was predicted using the fecal spectral data alone). The NIRS models showed an accurate prediction of the PS index, and the comparison of the calculated digestibility coefficients with those of the reference method showed no significant differences. In conclusion, the hybrid approach can accurately estimate the digestibility of nutrients and furthermore, it only relies on the chemical information and not on any physical property of feed and feces, which may negatively affect digestibility prediction. In addition, the use of ANNs can improve the predictive power of digestibility models, especially in unprepared samples (fresh intact fecal pellets), which is of particular practical importance. The results of this thesis are followed by some limitations that must be taken into account. Initially, the models developed are for the specific samples used for calibration/validation, so using the models beyond these samples, i.e., on future unknown samples, may not give similar results. For the wide application of the models, an expansion of the calibration groups is also required. As observed in some of the examined parameters, the unsatisfactory results from the validation groups, despite the very good statistics in the calibration groups, indicated that the expansion of the sample dataset is required to increase the variability of the considered parameter.