Σκοπός της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής είναι η συλλογή και επεξεργασία όλων εκείνων των δεδομένων που συντελούν στην εύρεση βιολειτουργικών ιδιοτήτων γαλακτοκομικών υποπροϊόντων με έμφαση στις ανοσορυθμιστικές, αντιυπερτασικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες του τυρογάλακτος και του όξινου ορού γιαούρτης (ΟΟΓ). Το τυρόγαλα είναι υποπροϊόν της τυροκόμησης, ενώ ο ΟΟΓ προέρχεται κατά την παρασκευή στραγγιστής γιαούρτης. Οι σημαντικότερες διαφορές τους είναι ότι ο ΟΟΓ έχει χαμηλότερο pH και μικρότερη περιεκτικότητα σε πρωτεΐνες σε σχέση με το τυρόγαλα. Η ραγδαία αύξηση του παγκόσμιου πληθυσμού, η ανάγκη του ανθρώπου για στροφή σε λειτουργικά τρόφιμα σε συνδυασμό με την εξέλιξη της επιστήμης και της τεχνολογίας οδήγησε στην έρευνα για την αξιοποίηση των γαλακτοκομικών υποπροϊόντων, συμπεριλαμβανομένου του τυρογάλακτος και του ΟΟΓ. Η συνεχής αύξηση της παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων οδηγεί σε τεράστιες ποσότητες υποπροϊόντων, για αυτό κρίνεται επιτακτική ανάγκη της αξιοποίησής τους με νέους τρόπους για την παραγωγή καινοτόμων προϊόντων με ποικίλες εφαρμογές
Αρχικά, συλλέχθηκαν γαλακτοκομικά υποπροϊόντα από αγελαδινό, πρόβειο, αίγειο και αιγοπρόβειο (μόνο για το τυρόγαλα) γάλα από διάφορες βιομηχανίες παραγωγής γαλακτοκομικών προϊόντων και μικρά τυροκομεία της ηπειρωτικής Ελλάδας κατά τη διάρκεια του έτους. Ακολούθησε λυοφιλίωση των δειγμάτων και in vitro προσομοίωση της γαστρεντερικής πέψης με ένα ευρέως χρησιμοποιούμενο στατικό μοντέλο. Έπειτα έγινε χρήση μεμβρανών διήθησης μοριακού βάρους αποκοπής 10 kDa και 3 kDa για το διαχωρισμό των πεπτιδίων.
Για τη μελέτη των ανοσορυθμιστικών ιδιοτήτων (πρώτο μέρος της πειραματικής μελέτης) χρησιμοποιήθηκαν η ανθρώπινη κυτταρική σειρά μονοκύτταρων/ μακροφάγων THP-1 (με και χωρίς πρόκληση LPS) και η κυτταρική σειρά μακροφάγων μυός RAW 264.7 (μόνο με πρόκληση LPS). Για τη διερεύνηση της ανοσιακής ρύθμισης, μελετήθηκε η επίδραση του κλάσματος της πέψης αποτελούμενο από πεπτίδια μοριακού βάρους <3 kDa (D-P3) στη γονιδιακή έκφραση κυτοκινών, μεταγραφικών παραγόντων και άλλων πρωτεϊνών που εμπλέκονται στην ανοσιακή απόκριση καθώς και η αναστολή παραγωγής του νιτρικού οξέος (NO). Παρατηρήθηκαν αρκετές αλλαγές στη γονιδιακή έκφραση και ενδεικτικά αναφέρονται μερικές από αυτές. Εντοπίστηκαν μειωμένα επίπεδα έκφρασης mRNA των IL1B και ICAM1 σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε πρόβειο και αιγοπρόβειο τυρόγαλα και μειωμένα επίπεδα έκφρασης mRNA των IL6 και TLR4 μόνο για το πρόβειο τυρόγαλα. Επίσης, παρατηρήθηκε αύξηση της σχετικής έκφρασης CXCL8 για αγελαδινό, πρόβειο και αιγοπρόβειο τυρόγαλα σε σχέση με το BL-D-P3. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε μείωση των επιπέδων mRNA του STAT2, NFE2L2, HMOX, SOD και CAT στα THP-1 κύτταρα που εκτέθηκαν σε τυρόγαλα σε σχέση με τα BL-D-P3. Μετά την έκθεση των κυττάρων σε LPS, εντοπίστηκε στατιστικώς σημαντική αύξηση των CXCL8 και CAT για το τυρόγαλα ανεξαρτήτως ζωικής προέλευσης σε σχέση με τα κύτταρα που είχαν εκτεθεί στο BL-D-P3, ενώ παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης του IRF5. Τα επίπεδα TNF και STAT1 ήταν στατιστικώς υψηλά μόνο για το πρόβειο τυρόγαλα και η γονιδιακή έκφραση των ICAM1, STAT2, MYD88 και HMOX1 σε κύτταρα που εκτέθηκαν σε αγελαδινό τυρόγαλα. Περαιτέρω, παρατηρήθηκε μείωση της έκφρασης των IL1B, TGFB, LST1, NFKB1, STAT2, MYD88, CXCL8 και TLR2 στα THP-1 μακροφάγα που εκτέθηκαν σε πρόβειο ΟΟΓ. Μετά την έκθεση των κυττάρων σε LPS, εντοπίστηκε μείωση των TLR4 και IRF5 για τον πρόβειο ΟΟΓ, ενώ παρατηρήθηκε αύξηση της έκφρασης του IL10 και STAT1 για αγελαδινό και αίγειο ΟΟΓ. Αναφορικά με το αντιφλεγμονώδες δυναμικό που μελετήθηκε σε RAW 264.7 ενεργοποιημένα κύτταρα παρουσία D-P3 τυρογάλακτος παρουσιάστηκε μείωση της γονιδιακής έκφρασης του Nos2 για το αίγειο και πρόβειο τυρόγαλα σε σύγκριση με το BL-D-P3. Η μείωση αυτή μεταφράστηκε σε μείωση παραγωγής NO μόνο στο πρόβειο τυρόγαλα. Αντίστοιχα, παρατηρήθηκε μειωμένη παραγωγή NO για το πρόβειο και αίγειο ΟΟΓ τόσο με το BL-D-P3 όσο και με το αγελαδινό ΟΟΓ, χωρίς ωστόσο να υπάρχει ανάλογη μείωση των επιπέδων mRNA του Nos2.
Για τη μελέτη των αντιυπερτασικών ιδιοτήτων (δεύτερο μέρος της πειραματικής διαδικασίας), προσδιορίστηκε η ACE ανασταλτική δράση του τυρογάλακτος και του ΟΟΓ, πριν και μετά την in vitro πέψη για το κλάσμα D-P3 και το κλάσμα της πέψης αποτελούμενο από πεπτίδια μοριακού βάρους <10 kDa (D-P10), καθώς έχει αναφερθεί πως η αντιυπερτασική δράση συνδέεται με τα χαμηλού μοριακού βάρους πεπτίδια που προκύπτουν από τη γαστρεντερική πέψη. Η αναστολή του ACE μετά την in vitro πέψη ήταν σημαντικά υψηλότερη τόσο για το D-P10 όσο και για το D-P3 σε σύγκριση με τα αρχικά γαλακτοκομικά υποπροϊόντα. Επιπρόσθετα, παρατηρήθηκε αυξημένη ανασταλτική δράση του ACE στο πρόβειο τυρόγαλα για D-P10 και D-P3 σε σχέση με το αίγειο και αγελαδινό. Τα δείγματα τυρογάλακτος που συλλέχθηκαν από τη Δυτική Ελλάδα και Θεσσαλία είχαν καλύτερη αντιυπερτασική δράση για τα D-P3 σε σύγκριση με τις άλλες περιφέρειες. Ο παράγοντας της εποχικότητας δεν επηρέασε την ανασταλτική δράση του ACE για το τυρόγαλα, ενώ για τον ΟΟΓ παρατηρήθηκε βελτίωση της δράσης αυτής μετά την in vitro πέψη, για το κλάσμα D-P10, στα δείγματα που συλλέχθηκαν τους καλοκαιρινούς μήνες.
Για τη μελέτη των αντιοξειδωτικών ιδιοτήτων (τρίτο μέρος της πειραματικής διαδικασίας), προσδιορίστηκε η αντιοξειδωτική δράση των γαλακτοκομικών υποπροϊόντων με τις βιοχημικές μεθόδους ORAC, ABTS, FRAP και P-FRAP πριν και μετά την in vitro πέψη καθώς και του κλάσματος D-P3. Συνολικά, μετά την in vitro πέψη παρατηρήθηκε αυξημένη αντιοξειδωτική ικανότητα κατά 3-10 φορές, ανάλογα της μεθόδου που χρησιμοποιήθηκε. Εντοπίστηκε αύξηση πριν την πέψη, με τη μέθοδο ORAC για το αγελαδινό τυρόγαλα, με αυτήν τη διαφορά να απουσιάζει μετά την πέψη. Αντιθέτως, μεγαλύτερη αντιοξειδωτική δράση παρατηρήθηκε στο πρόβειο τυρόγαλα σε σχέση με το αγελαδινό με τη μέθοδο ABTS πριν και μετά την πέψη. Επίσης, παρατηρήθηκε αυξημένη αντιοξειδωτική δράση για τον πρόβειο ΟΟΓ μετά την πέψη με τη μέθοδο ORAC. Με την ίδια μέθοδο, εντοπίστηκαν διαφορές για το κλάσμα D-P3 ως προς την εποχικότητα, με τα καλοκαιρινά να εμφανίζουν καλύτερη αντιοξειδωτική δράση. Όσον αφορά τη γεωγραφική προέλευση των δειγμάτων, τα δείγματα που συλλέχθηκαν από την Πελοπόννησο και τη Στερεά Ελλάδα έδειξαν αυξημένη αντιοξειδωτική δράση πριν την πέψη με την ABTS μέθοδο. Τέλος, μελετήθηκε η αντιοξειδωτική δράση του D-P3 σε κυτταρικό επίπεδο με τη χρήση της ανθρώπινης κυτταρικής σειράς του παχέος εντέρου HT-29 παρουσία H2O2. Παρατηρήθηκε αυξημένη αναστολή των ROS για το πρόβειο τυρόγαλα σε σχέση με τα κύτταρα που είχαν εκτεθεί σε H2O2, καθώς επίσης παρατηρήθηκαν μειωμένα επίπεδα ROS για τα δείγματα που συλλέχθηκαν από τη Μακεδονία και Θράκη. Τέλος, τα δείγματα τυρογάλακτος κατά τους καλοκαιρινούς μήνες έδειξαν μειωμένη παραγωγή ROS. Αναφορικά με τον ΟΟΓ, το πρόβειο D-P3 είχε αυξημένη αναστολή ROS.
Συμπερασματικά, το τυρόγαλα και ο όξινος ορός γιαούρτης, σύμφωνα με τα αποτελέσματα της παρούσας διατριβής, θα μπορούσε να αξιοποιηθεί σε μεγαλύτερο βαθμό στη βιομηχανία παραγωγής τροφίμων και ζωοτροφών λόγω των ωφέλιμων δράσεων που επέδειξαν. Συνολικά, τα αποτελέσματα στοιχειοθετούν πως τα πρόβεια γαλακτοκομικά υποπροϊόντα είχαν καλύτερο προφίλ από τα γαλακτοκομικά υποπροϊόντα με αγελαδινή ή αίγεια προέλευση γάλακτος ως προς τις αντιυπερτασικές και αντιοξειδωτικές ιδιότητες ενώ ανέδειξαν και πιο ισχυρή ανοσορυθμιστική δράση. Επιπρόσθετα, η επιβεβαίωση των παρατηρούμενων διαφορών θα μπορούσε να επιτευχθεί με in vivo μελέτες σε ζώα ή κλινικές δοκιμές σε ανθρώπους. Περαιτέρω έρευνα κρίνεται επίσης αναγκαία για να προσδιοριστούν οι αλληλουχίες των πεπτιδίων από γαλακτοκομικά υποπροϊόντα με πιθανή ανοσορυθμιστική, αντιυπερτασική, αντιοξειδωτική δράση ή πλειοτροπική δράση in vivo.
The aim of the present study was to evaluate the biofunctional properties of dairy by-products, in particular, sweet whey (SW) and acid whey (AW), by-products resulted from hard and semi-hard cheeses manufacture and strained Greek yoghurt processing, respectively. A thorough analysis on the immunomodulatory, antihypertensive and antioxidant properties of SW and AW was conducted. The major differences are based that AW has lower pH and lower protein content than SW. The rapid growth of the world population, the consumer interest to shift to biofunctional foods combined with the development of science and technology has led to research on the concurrent utilization of dairy by-products, including SW and AW. The continuous increase in the production of dairy products leads to enormous amounts of by-products, therefore it is imperative to utilize them in new ways to produce novel products with a variety of applications.
Firstly, dairy by-products were obtained from bovine, ovine, caprine and a mixture of ovine/caprine (only for SW) milk from dairy factories and several small-scale cheese plants in mainland Greece during the year. Freeze-drying of liquid SW and AW was carried out to remove water and other solvents, and then protein content of all samples was determined by the Kjeldahl method. Afterwards, the in vitro gastrointestinal digestion procedure of the samples was modified using the protocol reported by the amended and improved digestion method INFOGEST 2.0. Then, in order to remove high molecular weight peptides from digestates (D), membrane filters with 10 kDa (D-P10) and 3 kDa (D-P3) MWCO were used.
The human monocyte/macrophage cell line THP-1 (with and without LPS challenge) and the RAW 264.7 murine macrophage cell line (LPS challenge) were used to evaluate the immunomodulatory properties. The effect of D-P3 on gene expression of cytokines, transcription factors and other proteins implicated in the immune response as well as the inhibition of nitric oxide (NO) was studied in order to to investigate immune regulation. More than a few changes in gene expression were observed and some important ones are mentioned. Decreased IL1B and ICAM1 mRNA expression levels were noticed in cells exposed to ovine and mixture of ovine/caprine SW-D-P3 and decreased IL6 and TLR4 mRNA expression levels only for ovine SW-D-P3. CXCL8 relative expression was increased for bovine, ovine, ovine/caprine SW-D-P3 compared to BL-D-P3. Moreover, a decrease in STAT2, NFE2L2, HMOX, SOD and CAT mRNA levels was observed in THP-1 cells exposed to SW-D-P3 compared to BL-D-P3. After activation of cellw with LPS, a significant increase in CXCL8 and CAT was noticed for SW regardless of animal origin, while a decrease in IRF5 expression was observed. TNF and STAT1 levels were greater only for ovine SW-D-P3 and gene expression of ICAM1, STAT2, MYD88 and HMOX1 in cells incubated with bovine SW-D-P3. Furthermore, a decrease of IL1B, TGFB, LST1, NFKB1, STAT2, MYD88, CXCL8 and TLR2 expression was observed in THP-1 macrophages exposed to ovine AW-D-P3. After incubation of LPS, a reduction in TLR4 and IRF5 was presented for ovine AW-D-P3, while an increase of IL10 and STAT1 expression was observed for bovine and caprine AW-D-P3. Regarding the anti-inflammatory potential studied in RAW 264.7 activated cells, a decrease in Nos2 gene expression was observed for caprine and ovine SW-D-P3 compared to BL-D-P3. This decrease was translated into a reduced NO production only in ovine SW. Inhibition of NO production was observed for ovine and caprine AW-D-P3, although no corresponding reduction in Nos2 mRNA levels was detected.
For the study of antihypertensive properties, ACE inhibitory activity of SW and AW was determined before and after in vitro digestion for D-P3 and D-P10 fractions, as it has been reported that antihypertensive effect is associated with low molecular peptides resulting from gastrointestinal digestion. ACE inhibitory activity of SW and AW after in vitro digestion was greatly increased for both D-P10 and D-P3. Moreover, increased ACE inhibitory activity was observed in ovine SW-D-P10 and SW-D-P3 compared to caprine and bovine. SW obtained from Ditiki Ellada and Thessalia had better antihypertensive activity for D-P3 fraction compared to the other two regions. Seasonality did not affect ACE inhibitory activity of SW, while ACE inhibition of AW was improved after in vitro digestion for D-P10 fraction for AW collected during summer months.
For the study of antioxidant properties, the antioxidant activity of dairy by-products was determined by the biochemical methods ORAC, ABTS, FRAP and P-FRAP before and after in vitro digestion (D and D-P3 fraction). Overall, better antioxidant capacity of 3-10 times was observed after in vitro digestion, depending on the method used. An increase was observed before digestion by ORAC method for bovine SW, with this difference being absent after digestion. Conversely, greater antioxidant activity was observed in ovine SW compared to bovine SW by ABTS method before and after digestion. Moreover, better antioxidant activity was observed for ovine AW by ORAC after in vitro digestion. Differences were noticed for AW-D-P3 in terms of seasonality, with summer ones showing enhanced antioxidant activity. Regarding geographical origin of AW, samples obtained from the Peloponnese and Central Greece revealed augmented antioxidant activity before digestion by ABTS method. Then, cellular antioxidant activity of D-P3 was studied using HT-29, a human colon cell line, in the presence of H2O2. Inhibition of reactive oxygen species (ROS) of ovine SW-D-P3 was increased compared H2O2-treated cells, and ROS levels were decreased for samples obtained from Macedonia and Thrace. Finally, AW collected during summer months showed reduced ROS production and ovine AW-D-P3 had greater ROS inhibition compared to BL-D-P3.
In conclusion, according to the results of this thesis, SW and AW could be utilized to a greater extent in the food and feed industry due to their beneficial effects. The overall results document that ovine dairy by-products had a better profile than caprine and bovine ones regarding antihypertensive and antioxidant properties and a more robust immunomodulatory effect. As well, a validation of the observed differences could be achieved by in vivo animal studies or human clinical trials. Further research is also deemed necessary to determine the peptides΄ sequences of from dairy by-products with potential immunomodulatory, antihypertensive, antioxidant or pleiotropic activity in vivo.
