Μελέτη του παθοφυσιολογικού ρόλου της πρωτεΐνης RANKL στον μαστικό αδένα διαγονιδιακών ποντικών

Abstract

Ο καρκίνος του μαστού αποτελεί τον δεύτερο συχνότερο καρκίνο παγκοσμίως και την κύρια αιτία θανάτου στις γυναίκες. Ο RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand) έχει χαρακτηριστεί ως ο κύριος μεσολαβητής της ανάπτυξης του μαστικού αδένα από την προγεστερόνη κατά την εγκυμοσύνη, ενώ τελευταία δεδομένα τον εμπλέκουν στην ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση του μαστού. Η παρούσα διδακτορική διατριβή εστιάζει στη μελέτη του ρόλου του RANKL στη φυσιολογική ανάπτυξη του μαστικού αδένα αλλά και στην ανάπτυξη και εξέλιξη του καρκίνου του μαστού μέσω της χρήσης μοναδικών γενετικών μοντέλων υπερέκφρασης (ΤgRANKL) ή αδρανοποίησης (RANKLtles/tles) του RANKL στο ποντίκι. Πιο συγκεκριμένα, οι στόχοι της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν: α) η ανάπτυξη μεθόδου τρισδιάστατης απεικόνισης και ποσοτικοποίησης του μαστικού αδένα ποντικιών, β) η μελέτη της υπερέκφρασης του RANKL στην διαμόρφωση του μαστικού επιθηλίου σε διάφορα αναπτυξιακά και αναπαραγωγικά στάδια του ποντικιού όπως εφηβεία, ώριμο στάδιο, κύηση και γαλουχία, γ) η μελέτη των μοριακών και κυτταρικών μηχανισμών που εμπλέκονται στην αυξημένη πυκνότητα του μαστικού αδένα των TgRANKL ποντικιών, δ) η μελέτη της έλλειψης ή αναστολής του RANKL στην διαμόρφωση του μαστικού επιθηλίου στα πρώιμα στάδια ανάπτυξής του, ε) η κατανόηση της δράσης του RANKL στην ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση του μαστικού αδένα, ζ) η δημιουργία ενός ανθρωποποιημένου humTgRANKL διαγονιδιακού μοντέλου για τη μελέτη της ορμονο-επαγόμενης καρκινογένεσης αποκλειστικά μέσω του huRANKL και την εφαρμογή προκλινικών δοκιμών με τον αναστολέα του huRANKL Denosumab και η) η εύρεση του δικτύου των γονιδίων που απορρυθμίζονται κατά την ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση στο humTgRANKL μοντέλο και η επίδραση του Denosumab στην έκφρασή τους. Αρχικά, αναπτύξαμε μια νέα μέθοδο για την τρισδιάστατη απεικόνιση και ποσοτικοποίηση του μαστικού αδένα με υψηλή ευκρίνεια μέσω χρώσης του με φωσφοβολφραμικό οξύ (PTA) και ανάλυση με αξονική μικροτομογραφία (microCT). Στην συνέχεια, μελετήθηκε ο μαστικός αδένας των διαγονιδιακών TgRANKL ποντικιών κατά το ώριμο στάδιο μέσω ανάλυσης της δομής του με χρώση καρμίνης, microCT και ιστολογική ανάλυση, όπου παρατηρήθηκε σημαντικά αυξημένη πυκνότητα του δικτύου των γαλακτοφόρων πόρων και κυρίως των δευτερογενών και τριτογενών διακλαδώσεων συγκριτικά με τα αγρίου τύπου (WT) ποντίκια. Ανάλυση της έκφρασης έδειξε υπερέκφραση του διαγονιδίου huRANKL στον μαστό των TgRANKL ποντικιών με εντοπισμό στα επιθηλιακά κύτταρα του αυλού αλλά και αύξηση της έκφρασης δεικτών που σχετίζονται με τον πολλαπλασιασμό των επιθηλιακών κυττάρων και των βλαστοκυττάρων. Ανάλυση των μαστικών αδένων με κυτταρομετρία ροής αποκάλυψε αύξηση των επιθηλιακών κυττάρων του αυλού και των βλαστοκυττάρων στα TgRANKL ποντίκια. Η μείωση της πυκνότητας του μαστικού επιθηλίου και των δεικτών πολλαπλασιασμού στα TgRANKL ποντίκια έπειτα από τη χορήγηση του μονοκλωνικού αντισώματος Denosumab, που αποτελεί αναστολέα του huRANKL, επιβεβαίωσε τη δράση του διαγονιδίου στο φαινότυπο αυτό. Η συγκριτική ανάλυση έκφρασης σε ώριμους μαστικούς αδένες μεταξύ TgRANKL και WT ποντικιών με αλληλούχηση RNA (RNA-Seq) έδειξε ότι η υπερέκφραση του huRANKL οδηγεί σε επαγωγή σηματοδοτικών μονοπατιών και γονιδίων που σχετίζονται με την ανάπτυξη, το πολλαπλασιασμό, το μεταβολισμό, τη διέγερση των ορμονών και τον καρκίνο, ενώ επιβεβαιώθηκε η έκφραση επιλεγμένων γονιδίων με qPCR. Στην εγκυμοσύνη και τη γαλουχία, επίσης, τα TgRANKL ποντίκια εμφανίζουν πιο εκτεταμένη ανάπτυξη των κυψελίδων, ενώ στην εφηβεία παρουσιάζουν ταχύτερη ανάπτυξη του μαστικού επιθηλίου και αύξηση των τελικών λοβιακών μονάδων (TEBs) σε σχέση με τα WT. Επιπλέον, διαπιστώσαμε ότι η απουσία του RANKL παρεμποδίζει την ανάπτυξη του μαστικού αδένα κατά την εφηβεία, τόσο σε γενετικό μοντέλο όσο και με φαρμακευτική αναστολή του RANKL. Επιπρόσθετα, η υπερέκφραση του huRANKL στα TgRANKL ποντίκια δεν επηρέασε την ανάπτυξη και τα χαρακτηριστικά των ορμονο-επαγόμενων (MPA/DMBA) όγκων σε σχέση με τα WT ποντίκια, αν και η αναστολή του RANKL με OPG-Fc μείωσε τη συχνότητα εμφάνισης όγκων αλλά και τον αριθμό των όγκων ανά ποντίκι. Στην συνέχεια, δημιουργήσαμε ένα ανθρωποποιημένο διαγονιδιακό μοντέλο (humTgRANKL) για την μελέτη της ορμονο-επαγόμενης καρκινογένεσης αποκλειστικά μέσω του huRANKL. Τα humTgRANKL ποντίκια ανέπτυξαν όγκους στον ίδιο βαθμό με τα TgRANKL και WT ποντίκια. Η προφυλακτική θεραπεία των humTgRANKL ποντικιών με Denosumab ανέστειλε την εμφάνιση όγκων στο μαστό καθώς και τα πρώιμα στάδια καρκινογένεσης, ενώ η θεραπευτική αγωγή δεν ήταν εξίσου αποτελεσματική στην παρεμπόδιση εμφάνισης των όγκων, υποδηλώνοντας τη σημασία του RANKL κυρίως στα αρχικά στάδια της ογκογένεσης. Τέλος, ανιχνεύθηκε το δίκτυο των γονιδίων που απορυθμίζονται κατά την ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση στα humTgRANKL ποντίκια αλλά και η επίδραση της προφυλακτικής θεραπείας με Denosumab στην έκφρασή τους, μέσω RNA-Seq ανάλυσης σε παρακείμενους μαστικούς αδένες. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν πληθώρα γονιδίων που εμπλέκονται σε διεργασίες και μονοπάτια καρκινογένεσης του μαστού και επάγονται από την RANKL σηματοδότηση. Συνολικά, τα αποτελέσματά μας αναδεικνύουν τον RANKL ως ένα σημαντικό παράγοντα για την φυσιολογική ανάπτυξη του μαστικού επιθηλίου σε διάφορα αναπτυξιακά στάδια, αλλά και στην ορμονο-επαγόμενη καρκινογένεση. Η εύρεση γονιδίων που απορυθμίζονται κατά την καρκινογένεση και η αξιολόγηση νέων φαρμάκων έναντι του ορμονο-επαγόμενου καρκίνου του μαστού στα humTgRANKL ποντίκια, θα μπορούσε να συμβάλει στην κατανόηση των μηχανισμών καρκινογένεσης και στην ανάπτυξη στοχευμένων προκλινικών δοκιμών στον καρκίνο του μαστού.

Breast cancer is the second most common cancer worldwide and the primary cause of death in women. RANKL (Receptor Activator of Nuclear Factor κB Ligand) has been identified as the main mediator of mammary gland development by progesterone during pregnancy, and recent data implicate it in hormone-induced breast cancer. This doctoral thesis focuses on studying the role of RANKL in the physiological development of the mammary gland, as well as in the development and progression of breast cancer, using unique genetic mouse models of RANKL overexpression (TgRANKL) or inactivation (RANKLtles/tles). More specifically, the objectives of this doctoral thesis aimed to: a) Develop a three-dimensional imaging and quantification method for mouse mammary glands; b) Investigate the effect of RANKL overexpression in the structure of the mammary epithelium at various developmental and reproductive stages in mice, including adolescence, maturity, pregnancy, and lactation; c) Study the molecular and cellular mechanisms involved in the increased mammary gland density in TgRANKL mice; d) Analyze the effect of RANKL absence or inhibition in the early stages of mammary epithelium formation; e) Understand the role of RANKL in hormone-induced breast cancer; f) Create a humanized humTgRANKL genetic mouse model to study hormone-induced carcinogenesis exclusively through huRANKL and to perform preclinical trials with the huRANKL inhibitor Denosumab; g) Identify the network of genes that are deregulated during hormone-induced carcinogenesis in the humTgRANKL model and assess the impact of Denosumab on their expression. Initially, we developed a new method for three-dimensional imaging and quantification of the mammary gland with high resolution through staining with phosphotungstic acid (PTA) and analysis via micro-computed tomography (microCT). Subsequently, we studied the morphology of the mammary gland of TgRANKL mice at the mature stage with carmine staining, microCT, and histological analysis, demonstrating that TgRANKL mice develop increased density in the network of mammary ducts, especially secondary and tertiary branches when compared to wild-type (WT) mice. Expression analysis revealed overexpression of the huRANKL gene in the mammary glands of TgRANKL mice, and localization of the protein at the luminal epithelial cells. Moreover, the expression of genes related to the proliferation of epithelial cells and mammary stem cells was also found upregulated. Flow cytometry analysis showed an increase in luminal epithelial cells and mammary stem cells (MRU) in the mammary glands of TgRANKL mice. The decrease of mammary epithelial density and proliferation markers in TgRANKL mice treated with the monoclonal antibody Denosumab, an inhibitor of huRANKL, confirmed the role of the transgene in this phenotype. Comparative expression analysis in mature mammary glands between TgRANKL and WT mice through RNA sequencing (RNA-Seq) demonstrated that the overexpression of huRANKL induces the activation of signaling pathways and genes related to development, proliferation, metabolism, hormone signaling, and cancer. This was further validated by the expression of selected genes using qPCR. During pregnancy and lactation, TgRANKL mice also exhibited more extensive development of alveoli. In adolescence, TgRANKL mice showed faster development of mammary epithelium and an increase in terminal end buds (TEBs) compared to WT mice. However, the absence of RANKL inhibits mammary gland development, both in a genetic mouse model and through pharmacological inhibition of RANKL. Furthermore, the overexpression of huRANKL in TgRANKL mice did not affect the development and characteristics of hormone-induced (MPA/DMBA) tumors compared to WT mice. However, the inhibition of RANKL with OPG-Fc reduced both the frequency and the number of tumors per mouse. Subsequently, we created a humanized transgenic model (humTgRANKL) to study hormone-induced carcinogenesis exclusively through huRANKL. The humTgRANKL mice developed tumors to the same extent as TgRANKL and WT mice. Prophylactic treatment of humTgRANKL mice with Denosumab inhibited tumor formation in the mammary gland, as well as early stages of carcinogenesis. This highlights the importance of RANKL, especially in the early stages of oncogenesis. Finally, we identified the network of genes that are deregulated during hormone-induced carcinogenesis in humTgRANKL mice and assessed the impact of prophylactic treatment with Denosumab on their expression through RNA-Seq analysis in adjacent mammary glands. Our results revealed a plethora of genes involved in breast cancer processes and pathways induced by RANKL signaling. Overall, our findings emphasize the significance of RANKL in the physiological development of the mammary epithelium at various developmental stages as well as its crucial role in hormone-induced carcinogenesis. The discovery of deregulated genes during carcinogenesis and the evaluation of new drugs against hormone-induced breast cancer in humTgRANKL mice could contribute to the understanding of carcinogenesis mechanisms and the development of targeted preclinical trials in breast cancer.