Μελέτη της φυσιολογικής συμπεριφοράς της ζύμης Yarrowia lipolytica κατά την αύξηση της σε υποστρώματα με βάση τη γλυκερόλη

Abstract

Η ακάθαρτη γλυκερόλη είναι υποπροϊόν ποικίλων βιομηχανικών διεργασιών. Ο όγκος της παρουσιάζει αλματώδη αύξηση τα τελευταία χρόνια, συνεπώς η εξεύρεση λύσεων αναφορικά με την οικολογική και φιλική προς το περιβάλλον διαχείρισή της είναι μείζονος σημασίας. Παρουσιάζει δε το υλικό/υποπροϊόν τούτο εξαιρετικό ενδιαφέρον χρησιμοποιούμενο ως θρεπτικό υπόστρωμα για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας, μέσω της μικροβιακής τεχνολογίας. Ο στόχος της παρούσας διδακτορικής διατριβής ήταν η βιοτεχνολογική αξιοποίηση αυτού του υποπροϊόντος, ως υπόστρωμα ζυμώσεων του μικροοργανισμού Yarrowia lipolytica. Έτσι, άγρια (και σε πολλές περιπτώσεις μη προηγουμένως εκτενώς μελετηθέντα) στελέχη της πολυμορφικής μη-συμβατικής ζύμης Y. lipolytica, κυρίως απομονωμένα από Ελληνικής προέλευσης τρόφιμα (π.χ. Ελληνικό προζύμι, Ελληνικά ιχθυηρά), χρησιμοποιήθηκαν ως βιολογικό υλικό και μελετήθηκαν ως προς τη δυνατότητα αύξησής τους στην ακατέργαστη βιομηχανική γλυκερόλη. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιήθηκαν σε συνθήκες περιοριστικές ως προς την πηγή αζώτου, προκειμένου να κατευθυνθεί ο μικροβιακός μεταβολισμός προς τη σύνθεση εξωκυτταρικών δευτερογενών προϊόντων (κυρίως κιτρικού οξέος και πολυολών) ή και ενδοκυτταρικών δευτερογενών μεταβολιτών (κυρίως μικροβιακών λιπιδίων και ενδοπολυσακχαριτών). Ένας αρκετά μεγάλος αριθμός άγριων στελεχών της ζύμης Y. lipolytica, ήτοι τα στελέχη NRRL Y-323, NRRL Y-423, LGAM S7(1), Po1d (CLIB 139), FMCC Y-75, ACA-YC 5030, LMBF 20 και FMCC Y-74 χρησιμοποιήθηκαν ως βιολογικό υλικό των διεργασιών. Σε πρώτη φάση, χρησιμοποιήθηκε το στέλεχος FMCC Y-74 προκειμένουν να μελετηθεί κατά πόσο επηρεάζουν ή όχι οι προσμίξεις της βιομηχανικής γλυκερόλης την ικανότητα του μικροοργανισμού να αφομοιώσει το υπόστρωμα και να παράγει μεταβολικά προϊόντα. Στην συνέχεια, ακολούθησε επιλογή από το προηγούμενο πλήθος στελεχών της ζύμης Y. lipolytica, με γνώμονα τον υψηλό συντελεστή απόδοσης των πολυολών ως προς την αναλωθείσα γλυκερόλη. Διακρίθηκαν τα στελέχη NRRL Y-323, LMBF 20, ACA-YC 5030 και FMCC Y-74, ως τα πιο ελπιδοφόρα για την παραγωγή των μεταβολικών προϊόντων-στόχων. Μελετήθηκε επίσης, καθ’ όλη την πειραματική πορεία, η επίδραση του pH στην παραγωγικότητα των στελεχών. Περαιτέρω, επιδιώχθηκε και μελετήθηκε η σύνθεση των μεταβολικών προϊόντων υπό συνθήκες καταπόνησης, ήτοι καλλιεργειών σε αρκετά χαμηλή θερμοκρασία επώασης (20±1 ºC), σε παστεριωμένο θρεπτικό υλικό, σε μη θερμικά επεξεργασμένο θρεπτικό υλικό, υπό παρουσία μεταβλητών και ενίοτε υψηλών αρχικών συγκεντρώσεων χλωριούχου νατρίου (έως ~80 g/L) και υπό συνθήκες αυξημένης αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης (έως ~120 g/L). Σε όλες τις προηγούμενες καλλιέργειες η ανάπτυξη έλαβε χώρα σε αναδευόμενες φιάλες. Στην τελευταία φάση της πειραματικής διαδικασίας, τα στελέχη FMCC Y-74 και NRRL Y-323 που διακρίθηκαν από τις προαναφερθείσες συνθήκες και επέδειξαν ανθεκτικότητα συγχρόνως με υψηλή παραγωγή προϊόντων, καλλιεργήθηκαν σε εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρα (ενεργού όγκου 1,5 L), σε κλειστά και ημι-συνεχή τροφοδοτούμενα συστήματα xx ζύμωσης, υπό διαφορετικές συνθήκες σταθερού pH και ανάδευσης, προκειμένου να μεγιστοποιηθεί κατά το δυνατόν η παραγωγή των επιδιωκόμενων μεταβολικών προϊόντων. Πολλά από τα στελέχη που μελετήθηκαν κατά την καλλιέργειά τους στις αναδευόμενες φιάλες, παρουσίασαν πολύ ενδιαφέροντα αποτελέσματα, ενώ η διαφοροποίηση των συνθηκών καλλιέργειας διαφοροποίησε αξιοσημείωτα το προφίλ των παραγόμενων ενώσεων από τους μελετηθέντες μικροοργανισμούς. Έτσι, σε πολύ όξινες τιμές pH (2±0,3) σημειώθηκε αξιοσημείωτη μικροβιακή αύξηση και παραγωγή πολυολών, ενώ δεν παρατηρήθηκε παραγωγή κιτρικού οξέος. Όταν οι δοκιμές πραγματοποιήθηκαν σε ελαφρώς όξινες συνθήκες (pH=6±0,3), παρατηρήθηκε και εδώ ότι το κιτρικό οξύ δεν ήταν το κύριο μεταβολικό προϊόν, ενώ οι πολυόλες ήταν οι κυρίαρχοι μεταβολίτες, συντιθέμενες όμως σε μικρότερες ποσότητες σε σύγκριση με το πολύ όξινο περιβάλλον. Περαιτέρω, οι συνθήκες παστερίωσης αναδείχθηκαν ικανοποιητικές για την παραγωγή βιομάζας, ως επίσης και η χαμηλή θερμοκρασία των 20±1 ºC, η οποία μέχρι πρότινος δε θεωρούνταν ικανοποιητική για την καλλιέργεια των στελεχών αυτού του είδους. Η προσθήκη χλωριούχου νατρίου στο μέσο της αύξησης είχε ως απόρροια τη στροφή του μεταβολισμού των ζυμών προς την παραγωγή κιτρικού οξέος. Τέλος, καλλιέργειες οι οποίες εγένοντο σε συστήματα φιαλών με υψηλή αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης (~120 g/L) και πολύ όξινο pH (2±0,3), συνοδεύτηκαν από παραγωγή συνολικών πολυολών (μαννιτόλης, αραβιτόλης και ερυθριτόλης) ίση προς 79,7 g/L για το στέλεχος FMCC Y-74, για το στέλεχος NRRL Y323 ίση με 74,8 g/L και 57 g/L συνολικών πολυολών για το στέλεχος ACA-YC 5030. Τα πιο ενδιαφέροντα από τα στελέχη που μελετήθηκαν στα προηγούμενα εδάφια, μελετήθηκαν κατά την αύξησή τους σε εργαστηριακής κλίμακας βιοαντιδραστήρες. Το στέλεχος FMCC Y-74 καλλιεργήθηκε σε βιοαντιδραστήρες εργαστηριακής κλίμακας ενεργού όγκου 1,5 L σε ζυμώσεις ημισυνεχούς τροφοδοτούμενης λειτουργίας υπό διάφορες τιμές σταθερού pH και ποικίλες συνθήκες ανάδευσης (και συνεπώς αερισμού) με στόχο τη μεγιστοποίηση της συγκέντρωσης των επιδιωκόμενων μεταβολικών προϊόντων στο περιβάλλον του βιοαντιδραστήρα. Σημαντικές ποσότητες κιτρικού οξέος (~50 g/L, για πρώτη φορά τόσο υψηλές συγκεντρώσεις του προϊόντος αυτού στην παρούσα μελέτη) καταγράφηκαν μόνο όταν η τιμή του pH στο μέσο ήταν κοντά στις ελαφρώς όξινες συνθήκες (pH=6±0,3) με ταυτόχρονη σημαντική ανάδευση (750±5 rpm), η οποία εξασφάλιζε υψηλό βαθμό κορεσμού οξυγόνου στο περιβάλλον της αύξησης. Από την άλλη πλευρά, η πολύ υψηλή συγκέντρωση ολικών πολυολών 89,4 g/L και απουσία κιτρικού οξέος καταγράφηκε σε ελαφρά όξινες συνθήκες (pΗ=6±0,3) και υπό χαμηλή ανάδευση (250±5 rpm) με απόρροια χαμηλές τιμές συγκέντρωσης διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο της αύξησης. Για όλα τα στελέχη που μελετήθηκαν και παρά την εφαρμογή των συνθηκών καλλιέργειας που ευνοούν τη βιοχημική διεργασία της de novo συσσώρευσης αποθεματικών λιπιδίων (δηλαδή θρεπτικά μέσα τα οποία είναι περιοριστικά σε άζωτο και ευρισκόμενα υπό περίσσεια άνθρακα), όλα τα στελέχη απέτυχαν να παράξουν σημαντικές ποσότητες κυτταρικών λιπιδίων, μετατοπίζοντας ως εδείχθη, το μεταβολισμό τους προς τη σύνθεση εξωκυτταρικών προϊόντων (ήτοι πολυολών και σε μικρότερο βαθμό xxi κιτρικού οξέος). Ως εκ τούτου, στην πλειονότητα των περιπτώσεων, η συγκέντρωση των λιπιδίων επί ξηράς μικροβιακής μάζας παρέμεινε κάτω του ~20% w/w. Επίσης, καταγράφηκαν ποσότητες (έως 30% w/w επί ξηράς ουσίας) ενδοκυτταρικών πολυσακχαριτών, ενώ σε πολλές από τις περιπτώσεις παρατηρήθηκε ανακατανάλωση του παραγόμενου λίπους κατά το στάσιμο στάδιο του αυξητικού κύκλου, που συνέβη ταυτόχρονα με την έκκριση των εξωκυτταρικών προϊόντων. Εν κατακλείδι, θα πρέπει να τονιστεί ότι παρά το γεγονός ότι το βιοχημικό μονοπάτι σύνθεσης των πολυολών στα κύτταρα των ζυμών του είδους Y. lipolytica ακόμη δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί πλήρως, η παρούσα μελέτη απέδειξε ότι οι συνθήκες αύξησης για πολλά άγρια στελέχη ζυμών του ανωτέρω είδους (π.χ. το πολύ όξινο pH, ήτοι οι τιμές 2±0,3, η σχετικά χαμηλή ανάδευση και ο συνακόλουθος χαμηλός κορεσμός σε οξυγόνο, ο υψηλός περιορισμός σε άζωτο, η υψηλή αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης, κ.λπ.) ευνοούν την παραγωγή πολυολών. Εδείχθη ότι για αρκετά στελέχη, παρά το σχετικά ελαφρώς όξινο pH του μέσου (6±0,3) που επεβλήθη, η παραγωγή πολυολών εξακολουθούσε να είναι αρκετά σημαντική και σε αντιδιαστολή με πολλά αποτελέσματα που εμφανίζονται στη διεθνή βιβλιογραφία, ο μεταβολισμός δεν εστράφη προς την παραγωγή κιτρικού οξέος. Συνδυαστικά με τη βιοσύνθεση ενδοπολυσακχαριτών και την αλληλεπίδραση τους σε σχέση με τη συσσώρευση μικροβιακών λιπιδίων η διεργασία αυτή παρουσιάζει εξαιρετικό ακαδημαϊκό ενδιαφέρον, καίτοι αμφότεροι οι ανωτέρω ενδοκυτταρικοί μεταβολίτες δεν ήταν τα κύρια προϊόντα των ζυμώσεων οι οποίες έλαβαν χώρα. Με βάση την παρούσα εργασία συνεπώς, καθίσταται προφανές ότι είναι εφικτή η δυνατότητα εξεύρεσης ποικίλων λύσεων αναφορικά με την οικολογική και φιλική προς το περιβάλλον διαχείριση της ακάθαρτης γλυκερόλης, μέσω της μικροβιακής τεχνολογίας. Τα ευρήματα της παρούσας διδακτορικής διατριβής θα μπορούσαν να αποτελέσουν έναυσμα για μελλοντικές μελέτες, με τελικό στόχο τη μείωση του κόστους μέσω της χρήσης πράσινων και οικολογικώς φιλικών διεργασιών σχετιζόμενων με την παραγωγή πολυολών σε βιομηχανική κλίμακα.

Biodiesel fuels, defined as (mostly) methyl-esters and to lesser extent ethyl- or butyl-esters of various types of fatty acids, resulting from trans-esterification of low-value natural oils and fats, already represent a very important alternative type of fuel for the various types of diesel engines and heating systems. Due to the potential exhaustion of conventional fuels and to the various environmental issues that are currently imposed (i.e., constantly increasing CO2 emissions due to the utilization of nonrenewable fuels, global warming phenomenon, etc.), the application of biofuels on a large commercial scale is strongly recommended by the various authorities and funding bodies. Given that biodiesel derives from triacylglycerol transesterification yielding in both the fatty acid alky-esters (viz. the biodiesel) and the side-production of glycerol, the significant expansion of biodiesel that has occurred the last years, has already resulted in the generation of very high quantities of (crude viz. unpurified) glycerol into the market volume, as glycerol is the main side-product of this very industrial activity. To give the magnitude of the problem, we should indicate that the synthesis of 10 portions of biodiesel generates c. 1 portion of glycerol (with purity ~90% w/w) as by-product of the process, while besides biodiesel production process, significant quantities of glycerol-containing waters that are composed of varying concentrations of glycerol, are also generated through bioethanol and alcoholic beverages production units and through various other oleochemical industrial activities. Therefore, glycerol valorization should have much to offer in the cost reduction of the overall industrial production cost, for the mentioned agro-industrial activities. Within the frame of this important problem, viz. the discovery of eco-friendly and “green” ways of valorization of crude glycerol, is found the current thesis. In fact, it was decided to utilize various wildtype strains of the non-conventional yeast Yarrowia lipolytica and assess their potential related to the consumption of biodiesel-derived glycerol and produce a plethora of important metabolites of biotechnological interest. Therefore, the capability of newly isolated wild-type strains of the mentioned yeast, namely the strains NRRL Y-323, NRRL Y-423, LGAM S7(1), Po1d (CLIB 139), FMCC Y-75, ACA-YC 5030, LMBF 20 and FMCC Y-74, to consume biodiesel-derived glycerol and produce in noticeable quantities extra-cellular and intra-cellular metabolites under various culture conditions was assessed. All trials were performed under nitrogen-limited conditions in shake-flask mode and in batch and fed-batch bioreactor, and the potential for polyol production was significant for all strains at low pH values (pH=2±0,3). In the initial phase, an examination was conducted to determine whether the addition of industrial glycerol, deriving from transesterification of “used/cooked” oils had a negative impact on one of the mentioned strains capacities to consume the substrate and synthesize metabolic products, as compared to the “pure” substrate, and indeed growth and metabolites production was not altered by the presence of the industrial feedstock. Thereafter, the strains NRRL-323, LMBF 20, ACA-YC 5030 and FMCC Y-74 were xxiii found to be the most promising for the production of the intended metabolic products. The synthesis of the metabolic products was investigated in nitrogen-limited experiments imposed in order to “boost” the production of non-growth associated metabolites like sugar-alcohols, citric acid, microbial lipids and endopolysaccharides. Besides nitrogen limitation, growth was performed under stressful conditions, therefore trials were conducted under noticeably low temperatures (viz. 20±1 °C), under previously pasteurized conditions, under non-previously thermally treated at all conditions, in the presence of variable concentrations of sodium chloride (up to 80 g/L) and under high initial glycerol concentrations (up to ~120 g/L) in shake-flask experiments. Many of the studied strains presented very interesting results while the differentiation of the culture conditions notably diversified the metabolic compounds synthesized. In low pH values (2±0,3) noticeable growth and production of polyols occurred. When trials were performed at slightly acidic conditions (pH=6±0,3), interestingly citric acid was not the principal product, while polyols were mainly synthesized but in lower quantities compared to growth at low pH values (2±0,3). The addition of NaCl, shifted the metabolism towards the synthesis of citric acid and to the detriment of the production of polyols. Despite the low temperature, many strains presented appreciable growth and biosynthesis of metabolites. Finally, in trials with high initial glycerol concentration (~120 g/L) and low incubation pH (2±0,3), flask experiments were accompanied by the production of 79,7 g/L of total polyols (mannitol, erythritol and arabitol) for the strain FMCC Y-74, 74,8 g/L for the strain NRRL Y-323 and 57 g/L for the strain ACA-YC 5030. During the concluding phase of the experimental procedure, the strain FMCC Y-74 that distinguished itself from the aforementioned conditions and displayed resistance on glycerol and NaCl, was cultivated in laboratory-scale bioreactors with an active volume of 1,5 L in fed-batch configurations with variable pH and stirring conditions, with the aim of maximizing the concentration of the intended metabolic products. Significant quantities of citric acid (~50g/L) were recorded only when the pH value into the medium was near the neutral one (pH=6±0,3) and significant agitation, viz. 750±5 rpm (thus, resulting in high oxygen saturation) was imposed into the medium. The very high concentration of total polyols ~90 g/L with no citric acid at all synthesized was recorded in the presence of slightly acidic conditions (pH=6±0,3) and low agitation, viz. 250±5 rpm (that resulted in low dissolved oxygen concentration values) imposed into the medium, at fed-batch bioreactor trials. For all strains studied, despite the implementation of culture conditions favoring the de novo lipid accumulation process (viz. trials performed under nitrogen-limited and carbon-excess media), all strains failed to produce significant amounts of cellular lipids, shifting their metabolism towards the synthesis of extra-cellular compounds (sugar-alcohols and citric acid). Therefore, in the majority of cases, the concentration of cellular lipid in dry cell weight (DCW) values remained below the threshold of ~20% w/w. Likewise; moderate and varying quantities (up to 30% w/w) of polysaccharides in DCW values were recorded. In many of the studied strains, the values of lipids in DCW were somehow elevated at the first culture steps, decreasing afterwards, simultaneously with the secretion of extra-cellular metabolites. xxiv On the other hand, the synthesis of polysaccharides was influenced by culture parameters, like the addition of salt or the imposition of low temperature. Overall, newly isolated wild-type strains of the yeast Y. lipolytica proved to be suitable candidates for the production of sugar-alcohols at increased concentrations when biodiesel-derived glycerol was employed as microbial substrate. Citric acid also was secreted in non-negligible concentrations in bioreactor experiments in which high agitation and slightly acidic pH were imposed into the medium. In contrast, the production of microbial lipid from glycerol, that has the potential to completely recycle the waste generated during the biodiesel production process, was not a very dominant phenomenon, whereas varying quantities of endopolysaccharides were synthesized. It is of great academic interest to study the biosynthesis of endopolysaccharides and their interaction with the accumulation of microbial lipids, and more studies in the future should be performed on this issue. The potential increase of biodiesel production in the near future leads to the necessity of discovering various integrated (bio)-processes for valorization of this residue (“bio-refinery approach”). The current study provided alternative ways of valorization of this residue, by using it as substrate by natural yeast species, in order to produce added-value metabolic compounds. As it was indicated in the present thesis, numerous solutions referring to the ecological and environmentally friendly valorization of biodiesel-derived glycerol were proposed, with microbial technology being able to contribute greatly to this important direction. Findings of the current thesis, therefore, can be the basis for future studies on this very important topic, with long-range impact.