Investigating the phenotypic response and underpinning mechanisms of inter-strain interactions of Listeria monocytogenes in foods and simulated food environments

Abstract

Listeria monocytogenes, a ubiquitous environmental microorganism, exhibits a remarkable ability to survive and grow in diverse environments, constituting a significant concern for ready-to-eat (RTE) products. Previous studies have identified the simultaneous presence of multiple L. monocytogenes strains, possibly introduced during processing. The coexistence in/on the same food products and subsequent invasion during ingestion adds complexity to the understanding of the pathogen's behaviour. Inter-strain interactions leading to growth inhibition have been demonstrated in substrates containing more than one L. monocytogenes strains. The objectives of the thesis encompassed a comprehensive evaluation of different L. monocytogenes strains (C5, 6179, ScottA and PL25) behaviour during various storage conditions. Specifically, evaluated the growth and inter-strain interactions in/on different matrices, such as laboratory media, dairy-based model systems, and actual Ricotta and Camembert products. The study also examined the impact of co-culture on survival during exposure to simulated gastric fluid, growth dynamics in/on different media, and the role of cell proximity on the time to first division. Intracellular proteins and metabolic fingerprints were analysed to uncover mechanisms behind observed strain inhibition during co-culture. Chapter 2, revealed that strain-dependent variations occur under different oxygen and substrate structure conditions. Liquid media under aerobic conditions favoured higher final populations. Notably, inter-strain interactions were more pronounced in liquid substrates, as well, while "weaker" strains consistently reached lower final populations, irrespective of oxygen conditions and strain combinations. Chapter 3 highlighted nutritional composition differences affecting L. monocytogenes growth in/on Ricotta- and Camembert-based media. Inter-strain interactions were more pronounced in dairy-based broths, mitigated by agar addition and solidification, while anoxic conditions prolonged lag phases. Chapter 4 explored matrix adaptation effects, indicating that adaptation did not significantly alter growth or inter-strain interactions. Cheese matrix influenced inter-strain interactions, contributing to an understanding of serotype dominance in safety-concerned foods. Camembert-induced habituation leads to acid sensitization, affecting exposure to simulated gastric fluid. Chapter 5 demonstrated yeast extract's impact on pathogen’s growth and revealed that nutrient renewal did not overcome suppression effects during co-culture. Cell-free spent media analysis showed complex differences, with no observed inter-strain interactions during growth. Chapter 6 demonstrated that the density and relative proximity of observed cells, whether single or dual strains, influenced the time to the first division. Interestingly, the co-culture of different strains had no significant impact on time to first division. Finally, Chapter 7 identified numerous intracellular proteins produced uniquely during co-culture, including the luxS enzyme associated with quorum sensing. "Moonlighting" proteins, multifunctional proteins, were also identified. Overall, the thesis findings underscore how substrate characteristics, oxygen availability, and nutritional factors influence inter-strain interactions. The coexistence of multiple strains in the same food product is crucial for understanding listeriosis outbreaks, contributing valuable insights into the mechanisms of growth inhibition, which appear to involve a combination of contact-dependent inhibition and quorum sensing mechanisms.

Ο παθογόνος Listeria monocytogenes είναι ένας πανταχού παρών περιβαλλοντικός μικροοργανισμός, που επιδεικνύει μια αξιοσημείωτη ικανότητα να επιβιώνει και να αναπτύσσεται σε διαφορετικά περιβάλλοντα, αποτελώντας σημαντική ανησυχία για τα έτοιμα προς κατανάλωση προϊόντα (ΕΚΤ). Προηγούμενες μελέτες έχουν εντοπίσει την ταυτόχρονη παρουσία πολλαπλών στελεχών L. monocytogenes στο ίδιο τελικό προϊόν, που πιθανώς το επιμόλυναν κατά την αρασκευή ή/και επεξεργασία του. Η συνύπαρξη στα ίδια τρόφιμα και η επακόλουθη λοίμωξη που μπορεί να προκληθεί κατά την κατάποση προσθέτει πολυπλοκότητα στην κατανόηση της συμπεριφοράς του παθογόνου. Αλληλεπιδράσεις μεταξύ στελεχών που οδηγούν σε αναστολή ανάπτυξης έχουν αποδειχθεί σε υποστρώματα που περιέχουν περισσότερα από ένα στελέχη L. monocytogenes. Οι στόχοι της διατριβής περιελάμβάνουν μια ολοκληρωμένη αξιολόγηση της συμπεριφοράς διαφορετικών στελεχών του μικροοργανισμού L. monocytogenes (C5, 6179, ScottA και PL25) κατά τη διάρκεια διαφόρων συνθηκών συντήρησης. Συγκεκριμένα, η μελέτη αξιολόγησε την ανάπτυξη και τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στελεχών σε διαφορετικές υποστρώματα, με βάση εργαστηριακά υλικά, συστήματα προσομοίωσης τροφίμων που βασίζονται σε γαλακτοκομικά προϊόντα και πραγματικά προϊόντα Ricotta και Camembert. Η μελέτη εξέτασε επίσης τον αντίκτυπο της συνκαλλιέργειας στην επιβίωση κατά την έκθεση σε συνθετικό γαστρικό υγρό, τη δυναμική ανάπτυξης σε διαφορετικά υποστρώματα υπό την αξιολόγηση του ρόλου της εγγύτητας των κυττάρων στο χρόνο πρώτου διπλασιασμού. Οι ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες και τα μεταβολικά δακτυλικά αποτυπώματα που προέκυψαν από την ανάλυση με FTIR-ATR των cell-free υπερκειμένων, μετά από καλλιέργιεργεια μεμονομένων ή σε ζευγάρια στελεχών, αναλύθηκαν για να αποκαλυφθούν μηχανισμοί πίσω από την παρατηρούμενη αναστολή του στελέχους κατά τη διάρκεια της συγκαλλιέργειας. Το Κεφάλαιο 2 αποκάλυψε ότι η συμπεριφορά των στελεχών διαφοροποιήθηκε κάτω από διαφορετικές συνθήκες διαθεσιμότητας οξυγόνου και δομής υποστρώματος. Τα υγρά υποστρώματα, υπό αερόβιες συνθήκες, ευνόησαν την ανάπτυξη σε υψηλότερους τελικούς πληθυσμούς. Παράλληλα στα υγρά υποστρώματα ήταν πιο έντονες και οι αλληλεπιδράεις μεταξύ των στελεχών, ενώ τα «ασθενέστερα» στελέχη έφτασαν σταθερά σε χαμηλότερους τελικούς πληθυσμούς, ανεξάρτητα από τη διαθεσιμότητα οξυγόνου και τους συνδυασμούς στελεχών. Το Κεφάλαιο 3 τόνισε την επηροή που μπορεί να έχιε η διατροφική σύνθεση του τροφίμου στην ανάπτυξη του L. monocytogenes σε υποστρώματα που βασίζονται σε Ricotta και Camembert. Οι αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στελεχών ήταν πιο έντονες στα υγρά υποστρώματα με βάση τα γαλακτοκομικά προϊόντα. Η ένταση των αλληλεπιδράσεων μετριάστηκε από την προσθήκη άγαρ και τη στερεοποίηση, ενώ οι ανοξικές συνθήκες παρέτεινε την φάση προσαρμογής. Το Κεφάλαιο 4 διερεύνησε την επίδραση της ανάπτυξης του παθογόνου στα προϊόντα Ricotta και Camembert, υποδεικνύοντας ότι η προσαρμογή δεν άλλαξε σημαντικά την ανάπτυξη ή τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στελεχών. Η “προσαρμογή” μετά από ανάπτυξη στο Camembert οδήγησε σε μείωση της ανθεκτικότητας στο χαμηλό pH του συνθετικού γαστρικού υγρού. Το Κεφάλαιο 5 κατέδειξε την επίδραση του εργαστηριακού συστατικού yeast extract, στην ανάπτυξη του παθογόνου και αποκάλυψε ότι η ανανέωση των θρεπτικών συστατικών δεν ήταν ικανή να ανατρέψει το φαινόμενο της καταστολής της ανάπτυξης κατά τη συγκαλλιέργεια. Η ανάλυση των προφίλ των cell-free υπερκειμένων έδειξε διαφοποποιήσεις μεταξύ των μεμονομέμων και σύνθετων καλλιεργειών και κατά την ανάπτυξη στα cell-free υπερκείμενα δεν παρατηρήθηκαν αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στελεχών κατά την ανάπτυξη. Το Κεφάλαιο 6 έδειξε ότι η πυκνότητα και η σχετική εγγύτητα των παρατηρούμενων κυττάρων, είτε κατά την παρατήρηση μεμονωμένων στελεχών είτε σε ζεύγη, επηρέασαν το χρόνο πρώτου διπλασιασμού. Τέλος, το Κεφάλαιο 7 αναγνώρισε πολυάριθμες ενδοκυτταρικές πρωτεΐνες που παράγονται μοναδικά κατά τη συνκαλλιέργεια, συμπεριλαμβανομένου του ενζύμου luxS που σχετίζεται με την ανίχνευση απαρτίας. Εντοπίστηκαν επίσης πρωτεΐνες "Moonlighting", που αναφέρονται στη βιβλιογραφία ως πολυλειτουργικές πρωτεΐνες. Συνολικά, τα ευρήματα της διατριβής υπογραμμίζουν πώς τα χαρακτηριστικά του υποστρώματος, η διαθεσιμότητα οξυγόνου και οι διατροφικοί παράγοντες επηρεάζουν τις αλληλεπιδράσεις μεταξύ των στελεχών. Η συνύπαρξη πολλαπλών στελεχών στο ίδιο προϊόν διατροφής είναι ζωτικής σημασίας για την κατανόηση των κρουσμάτων λιστερίωσης, συμβάλλοντας σε πολύτιμες γνώσεις για τους μηχανισμούς αναστολής της ανάπτυξης, οι οποίοι φαίνεται να περιλαμβάνουν έναν συνδυασμό αναστολής εξαρτώμενης από την επαφή και μηχανισμών ανίχνευσης απαρτίας.