Dormancy at single cell level, colony growth dynamics and gene networks regulation under oxidative stress in Listeria monocytogenes

Abstract

Listeria monocytogenes is a foodborne pathogen often found in nature and the causal agent of the infection Listeriosis, with a mortality rate of 20-30%. In food-processing environments, L. monocytogenes faces unpredictable environmental changes that inflict exposure to different levels of stress, from sublethal to lethal. Adaptive response of L. monocytogenes to sublethal stress conditions may induce dormancy phenomena that are stochastically expressed at single-cell level, with varying capacity in subsequent recovery. Two closely related dormancy states are the Viable-But-Non-Culturable state (VBNC) and bacterial persistence. Entry into dormancy is a bet-hedging strategy that allows tolerance of harmful conditions. Induction of the VBNC state is crucial for foodborne pathogens, whose detection relies almost exclusively on the use of culture-based techniques. The main objectives of the present thesis were (i) to investigate dormancy phenomena induced by food-related stresses at single cell level; (ii) to estimate heterogeneity in the colonial outgrowth kinetics; and (iii) to decipher gene networks regulation under oxidative stress in Listeria monocytogenes. The approach followed to achieve these objectives was, first, to quantify the proportion of metabolically active, sublethally injured, VBNC and dead cells after exposure to food-related stress conditions, such as acid stress, and disinfectants, and to identify size colony variations (SCVs) associated with persistence. In order to reach this goal, fluorescence microscopy experiments coupled with CFDA / PI staining were supported by plate count experiments. Based on these findings, the following experiments were focused on the evaluation of the physiological state and the resuscitation capacity of the fraction of metabolically active (CFDA+PI-) L. monocytogenes cells on agar (colonial growth) vs broth (planktonic growth), using fluorescence activated cell-sorting. Then, the heterogeneity of the colonial growth dynamics was estimated and a stochastic approach was followed to predict the variability in growth to a large population. Finally, key elements that are involved in L. monocytogenes peracetic acid (PAA) stress response and regulation of gene networks under oxidative stress were identified using RNA-sequencing. In chapter 2, it was demonstrated that PAA induces sublethal injury and the VBNC state in L. monocytogenes. At population level, two distinct subpopulations with different colony morphotypes were identified after exposure to PAA, a phenomenon possibly induced by external factors to strengthen the ability of L. monocytogenes cells to survive. In chapter 3, it was shown that the unstained fraction of cells (CFDA-/PI-) remained undetected and thus non-culturable on Tryptic Soy Agar with 0.6% Yeast Extract (TSAYE). Moreover, phenotypic heterogeneity (SCVs) was detected after exposure to acetic acid (AA) pH 2.7 at 20oC at population level. At single cell level, after hydrochloric acid (HCl) treatment, a stochastic change in cells’ morphology from rod-shaped to spherical was detected. Molecular analysis also showed that after exposure to AA pH 2.7 at 20 oC the transcription levels of relA, clpP, mazE, mazF, gadB were statistically differentiated (up-regulated), indicating that exposure to pH 2.7 with AA at 20 oC induced persistence in L. monocytogenes. In chapter 4, comparing the resuscitation capacity of metabolically active PAA-treated cells on TSAYE and Tryptic Soy Broth with 0.6% Yeast Extract (TSBYE) resulted in significantly lower percentages of recovery on TSAYE compared to TSBYE (20 ppm for 90 min, 30 and 40 ppm for 30 min at 20oC), indicating that after exposure to PAA, the additional stress that L. monocytogenes cells experience due to the immobilized colonial type of growth, induces higher percentages of dormancy, i.e., the VBNC state, compared to the broth system. On the other hand, acid stress induced significantly higher percentages of the VBNC state in the planktonic type of growth. Assessment of the heterogeneity of colonial growth dynamics, in chapter 5, revealed that phenotypic switching was also demonstrated at single-cell level after PAA-treatment with the detection of two sub-populations in the first generations (1, 2 and 3) after exposure to PAA 30 ppm for 3 h at 20oC. The same pattern was observed after exposure to AA pH 2.5 for 5 h at 20oC. These findings indicate that individual L. monocytogenes cells follow bet-hedging principles that may be associated with enhanced markers of fitness. In chapter 6, transcriptome analysis of L. monocytogenes PAA-stressed cells revealed 12 differentially expressed genes. All genes were related to bacterial stress response. The organic peroxide toxicity protection (OhrA-OhrR) system, the Rli47 sRNA-regulated LMRG_00319- LMRG_00320 operon, the stringent control survival mechanism and a SOS response-related gene were induced under exposure of L. monocytogenes to PAA. This PhD thesis project aims to provide insights into the impact that dormancy phenomena in L. monocytogenes have in food safety. The importance of utilizing single-cell approaches with culture-based, at population level techniques in order to define the extent of bacterial heterogeneity and dormancy is also highlighted.

Ο τροφιμογενής παθογόνος μικροοργανισμός Listeria monocytogenes απαντάται συχνά στη φύση και αποτελεί τον αιτιολογικό παράγοντα της νόσου Λιστερίωσης, που χαρακτηρίζεται από ποσοστό θνησιμότητας 20-30%. Σε περιβάλλοντα επεξεργασίας τροφίμων, ο μικροοργανισμός L. monocytogenes αντιμετωπίζει απρόβλεπτες περιβαλλοντικές αλλαγές που προκαλούν έκθεση σε διαφορετικά επίπεδα στρες, από υποθανάτιο έως θανατηφόρο. Η προσαρμοστική απόκριση του L. monocytogenes σε συνθήκες υποθανάτιου στρες μπορεί να επάγει φαινόμενα ληθάργου που εκφράζονται στοχαστικά σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, με διαφορετική ικανότητα ανάκαμψης. Δύο στενά συνδεδεμένες καταστάσεις λήθαργου είναι τα Ζώντα αλλά Μη Καλλιεργήσιμα (VBNC) κύτταρα και η βακτηριακή ανθεκτικότητα. Η είσοδος σε λήθαργο είναι μια εξελικτική στρατηγική αντιστάθμισης του κινδύνου που επιτρέπει την ανοχή των επιβλαβών συνθήκων. Η επαγωγή της κατάστασης VBNC είναι ζωτικής σημασίας για τα τροφιμογενή παθογόνα, των οποίων η ανίχνευση βασίζεται σχεδόν αποκλειστικά στη χρήση τεχνικών καλλιέργειας. Οι κυριότεροι στόχοι της παρούσας Διδακτορικής Διατριβής ήταν (i) η διερεύνηση φαινομένων λήθαργου σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων που προκαλούνται από καταστάσεις στρες που σχετίζονται με τα τρόφιμα, (ii) η εκτίμηση της ετερογένειας των παραμέτρων κινητικής κατά την αποικιακή ανάπτυξη και (iii) η αποκρυπτογράφηση της ρύθμισης των γονιδιακών δικτύων υπό οξειδωτικό στρες στο μικροοργανισμό L. monocytogenes. Η προσέγγιση που ακολουθήθηκε για την επίτευξη αυτών των στόχων ήταν, πρώτον, να ποσοτικοποιηθεί η αναλογία των μεταβολικά ενεργών, υποθανάτια τραυματισμένων, VBNC και νεκρών κυττάρων μετά από έκθεση σε συνθήκες στρες που σχετίζονται με τα τρόφιμα, όπως το όξινο στρες και τα απολυμαντικά, και να προσδιοριστούν διαφορές στο μέγεθος των αποικιών (SCV) που σχετίζονται με την ανθεκτικότητα. Προκειμένου να επιτευχθεί αυτός ο στόχος, πειράματα μικροσκοπίας φθορισμού σε συνδυασμό με χρώση CFDA / PI υποστηρίχθηκαν από τη μέθοδο επίστρωσης σε τρυβλία. Με βάση αυτά τα ευρήματα, τα ακόλουθα πειράματα επικεντρώθηκαν στην αξιολόγηση της φυσιολογικής κατάστασης και της ικανότητας ανάκαμψης του υποπληθυσμού των μεταβολικά ενεργών (CFDA+PI-) κυττάρων σε στερεό θρεπτικό υπόστρωμα άγαρ (αποικιακή ανάπτυξη) έναντι υγρού θρεπτικού υποστρώματος (πλαγκτονική ανάπτυξη), χρησιμοποιώντας κυτταροδιαχωριστή ροής. Στη συνέχεια, εκτιμήθηκε η ετερογένεια στη δυναμική της ανάπτυξης των αποικιών και ακολουθήθηκε μια στοχαστική προσέγγιση για την πρόβλεψη της μεταβλητότητας κατά την ανάπτυξη. Τέλος, βασικά στοιχεία που εμπλέκονται στην απόκριση στρες που επάγεται από ΡΑΑ και στη ρύθμιση των δικτύων γονιδίων που επάγονται υπό οξειδωτικό στρες ταυτοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας τη μέθοδο της ανάλυσης γονιδιακής έκφρασης (RNA-sequencing). Τα αποτελέσματα του 2ου κεφαλαίου έδειξαν ότι το υπεροξικό οξύ (peracetic acid, PAA) επάγει τον υποθανάτιο τραυματισμό και την κατάσταση VBNC στον μικροοργανισμό L. monocytogenes. Σε επίπεδο πληθυσμού, εντοπίστηκαν δύο διακριτοί υποπληθυσμοί με διαφορετικούς μορφότυπους αποικιών μετά από έκθεση σε PAA, ένα φαινόμενο που πιθανώς επάγεται από εξωτερικούς παράγοντες για την ενίσχυση της ικανότητας επιβίωσης των κυττάρων. Στο 3ο κεφάλαιο δείχθηκε ότι το CFDA-/PI- κλάσμα κυττάρων παρέμεινε μη ανιχνεύσιμο και επομένως μη καλλιεργήσιμο στο στερεό θρεπτικό υπόστρωμα (TSAYE). Επιπλέον, ανιχνεύθηκε φαινοτυπική ετερογένεια (SCVs) μετά από έκθεση σε οξικό οξύ (acetic acid, AA) pH 2.7 στους 20oC σε επίπεδο πληθυσμού. Σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, ύστερα από έκθεση σε υδροχλωρικό οξύ (hydrochloric acid, HCl) ανιχνεύθηκε στοχαστική αλλαγή στη μορφολογία oρισμένων κυττάρων από σχήμα ράβδου σε σφαιρικό. Η μοριακή ανάλυση έδειξε ότι μετά από έκθεση σε AA pH 2.7 στους 20 oC τα επίπεδα έκφρασης των γονιδίων relA, clpP, mazE, mazF, gadB ήταν αυξημένα σε σχέση με τα δείγματα ελέγχου, υποδεικνύοντας ότι η έκθεση σε ΑΑ pH 2.7 στους 20oC επάγει την αντοχή του μικροοργανισμού L. monocytogenes. Στο 4o κεφάλαιο , η αξιολόγηση της ικανότητας ανάκαμψης των μεταβολικά ενεργών κυττάρων ύστερα από έκθεση σε PAA σε TSAYE και TSBYE οδήγησε σε σημαντικά χαμηλότερα ποσοστά ανάκαμψης στο TSAYE σε σύγκριση με το TSBYE (20 ppm για 90 min, 30 και 40 ppm για 30 min στους 20oC), υποδεικνύοντας ότι το πρόσθετο στρες που βιώνουν τα κύτταρα λόγω του αποικιακού τύπου ανάπτυξης, προκαλεί υψηλότερα ποσοστά λήθαργου, δηλ. κατάσταση VBNC, σε σύγκριση με τον πλαγκτονικό τύπο ανάπτυξης. Από την άλλη πλευρά, το όξινο στρες προκάλεσε σημαντικά υψηλότερα ποσοστά επαγωγής της κατάστασης VBNC στον πλαγκτονικό τύπο ανάπτυξης. Η αξιολόγηση της ετερογένειας στη δυναμική ανάπτυξης των αποικιών, στο κεφάλαιο 5, αποκάλυψε ότι η φαινοτυπική εναλλαγή επάγεται και σε επίπεδο μεμονωμένων κυττάρων, αφού μετά την έκθεση σε 30 ppm PAA για 3 ώρες στους 20oC δύο υποπληθυσμοί ανιχνεύθηκαν στις πρώτες γενιές (1, 2 και 3). Το ίδιο μοτίβο παρατηρήθηκε μετά από έκθεση σε AA pH 2,5 για 5 ώρες στους 20oC. Αυτά τα ευρήματα υποδεικνύουν ότι μεμονωμένα κύτταρα του μικροοργανισμού L. monocytogenes ακολουθούν τις αρχές της αντιστάθμισης κινδύνου. Στο κεφάλαιο 6, η ανάλυση της διαφορικής γονιδιακής έκφρασης ύστερα από έκθεση σε PAA αποκάλυψε 12 διαφορικά εκφρασμένα γονίδια. Όλα τα γονίδια σχετίζονταν με την απόκριση στο βακτηριακό στρες. Το σύστημα προστασίας από την τοξικότητα οργανικού υπεροξειδίου (OhrA-OhrR), το οπερόνιο LMRG_00319-LMRG_00320 που ρυθμίζεται από το Rli47 sRNA, ο μηχανισμός επιβίωσης αυστηρού ελέγχου και ένα γονίδιο που σχετίζεται με την απόκριση SOS επάχθηκαν κατά την έκθεση του μικροοργανισμού L. monocytogenes σε PAA. Η συγκεκριμένη Διδακτορική Διατριβή στοχεύει να διαλευκάνει τον τρόπο που τα φαινόμενα ληθάργου που επάγονται στον παθογόνο μικροοργανισμό L. monocytogenes επηρεάζουν την ασφάλεια των τροφίμων. Τονίζεται επίσης η σημασία της χρήσης μεθόδων μεμονωμένων κυττάρων σε συνδυασμό με τεχνικές ανίχνευσης σε επίπεδο πληθυσμού, προκειμένου να καθοριστεί η έκταση της βακτηριακής ετερογένειας και του λήθαργου.