De novo σύνθεση πρωτεϊνών Ιξού (Viscum album) από σωμακλωνικούς κάλλους και έλεγχος αντινεοπλασματικής δράσης σε καρκινικές σειρές

Abstract

O Eυρωπαϊκός ιξός, Viscum album subsp abietis, είναι ένα ημιπαρασιτικό φυτό που περιέχει βιοδραστικές πρωτεΐνες με φαρμακευτικές εφαρμογές στη θεραπεία του καρκίνου. Στον τομέα της βιοτεχνολογίας, η in vitro παραγωγή κάλων χρησιμεύει ως μια κρίσιμη εναλλακτική λύση για την παραγωγή βιομάζας και τη βιοσύνθεση φαρμακευτικών ενώσεων. Προηγούμενες μελέτες έχουν δείξει ότι η σωματοκλωνική διαφοροποίηση στις καλλιέργειες κάλλου ιξού μπορεί να οδηγήσει στην παραγωγή νέων πρωτεϊνών. Σε αυτό το πλαίσιο, αναλύθηκε το πρωτεινικό προφίλ από ιστούς και κάλους του Viscum album subsp. abietis με σκοπό την ταυτοποίηση πρωτεϊνών με αντικαρκινικές ιδιότητες. Οι κάλοι προήλθαν από έκφυτα βλαστών και τα φάσματα μάζας των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων υποβλήθηκαν σε πρωτεομική ανάλυση χρησιμοποιώντας ως αναφορά την αναθεωρημένη βάση δεδομένων Uniprot V. Εντοπίστηκαν σημαντικές διαφορές στην στο πρωτεϊνικό περιεχόμενο των κάλων και των μητρικών φυτών. Ταυτοποιήθηκαν, τέσσερις λεκτίνες ιξού, έξι βισκοτοξίνες και η λεκτίνη πρόσδεσης χιτίνης -cbML. Η διαδικασία της καλογένεσης προκάλεσε αλλαγές στη βιοσύνθεση πρωτεϊνών και στην έκφραση νέων πρωτεϊνικών ισομορφών. Οι κάλοι του γκι βρέθηκαν να έχουν ένα ξεχωριστό βιοσυνθετικό προφίλ πρωτεΐνης σε σύγκριση με τους ιστούς από τα φυτά δότες. Επιπλέον, αυτή η μελέτη διερεύνησε την παραγωγή σωματοκλωνικών πρωτεϊνών κατά την διαδικασία καλογένεσης του ιξού και αξιολόγησε πιθανές κυτταροτοξικές ιδιότητες έναντι των κυτταρικών σειρών καρκίνου του μαστού και του τραχήλου της μήτρας. Μελετήθηκαν επίσης πιθανά συνεργιστικά αποτελέσματα των πρωτεινικών εκχυλισμάτων σε συνδυασμό με τον χημειοθεραπευτικό παράγοντα 5-FU. Η επίδραση των πρωτεϊνικών παρασκευασμάτων στα κύτταρα HeLa αξιολογήθηκε χρησιμοποιώντας τη δοκιμασία ΜΤΤ, ενώ η οξειδωτική βλάβη και η επαγωγή απόπτωσης μετρήθηκαν χρησιμοποιώντας τις μεθόδους carboxy--H2-DCFDA, MitoSOX™ Red και Caspase-3. Αναπτύχθηκς ένας κυτταρικός βιοαισθητήρας με βάση τα κύτταρα και εφαρμόστηκε για τον προσδιορισμό των επιπέδων ανιόντος του σουπεροξειδίου. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι τα εκχυλίσματα πρωτεϊνών από τα φύλλα και τους μίσχους του γκι είχαν σημαντική επίδραση στα κύτταρα HeLa, προάγοντας οξειδωτική βλάβη και προκαλώντας απόπτωση, ειδικά όταν συνδυάζονταν με την 5-φθοροουρακίλη (5-FU). Αντίθετα, τα εκχυλίσματα ιξού εμφάνισαν τρόπο δράσης παρόμοιο με την καθαρή λεκτίνη Ι γκι (ML-I) και επέδειξαν διαφορετικά αποτελέσματα στο ρυθμό πολλαπλασιασμού των κυττάρων. Επιπλέον, πιθανά κυτταροτοξικά αποτελέσματα των πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων ερευνήθηκαν σε δύο κυτταρικές σειρές καρκίνου του μαστού, την MCF-7 και την τριπλά αρνητική MDA-MB-231, αποκαλύπτοντας σημαντική επίδραση στον κυτταρικό πολλαπλασιασμό, ιδιαίτερα όταν χρησιμοποιούνται σε συνδυασμό με την 5-FU. Αυτά τα ευρήματα παρέχουν την δυνατότητα ανακάλυψης νέων βιοδραστικών προιόντων με φαρμακευτικό ενδιαφέρον και να ενισχύσουν την κατανόησή για τις βιοχημικές οδούς στις οποίες επιδρούν οι πρωτεΐνες γκι για τη θεραπεία του καρκίνου

European mistletoe, Viscum album subsp abietis, is a semiparasitic plant containing bioactive proteins with pharmaceutical applications in cancer treatment. In the realm of biotechnology, in vitro callus production serves as a crucial alternative for biomass production and medicinal compounds biosynthesis. Previous studies have shown that somaclonal variation in mistletoe callus cultures can lead to the production of new proteins. In this context, protein content of Viscum album subsp. abietis tissues and biotechnologically propagated calluses, was analyzed to identify proteins with putative anticancer properties. Calluses were propagated from stem explants and protein extracts mass spectra were processed with Proteome Discoverer and a search was performed using as reference the Uniprot V. album reviewed database. Significant differences were noted in the protein content between calluses and the original plant tissues. Specifically, four mistletoe lectins, six viscotoxins, and the chitin-binding lectin-cbML were identified in the plant tissues. The process of callogenesis exhibited alterations in protein biosynthesis and the expression of novel protein isoforms. Mistletoe calluses were found to have a distinct protein biosynthetic profile compared to the donor plant tissues. Additionally, this study investigated the production of somaclonal proteins through mistletoe callus propagation and assessed their cytotoxic properties against breast and cervical cancer cell lines. The potential synergistic effects of these mistletoe protein extracts in combination with traditional chemotherapy (specifically, 5-FU) were also examined. The impact of the extracted proteins on HeLa cells was evaluated using the MTT proliferation assay, while oxidative damage and apoptosis induction were measured using sensitive methods such as carboxy-H2-DCFDA, MitoSOX™ Red, and Caspase-3 activation assays. A cell-based biosensor was utilized to determine superoxide levels. The results indicated that protein extracts from mistletoe leaves and stems had a substantial effect on HeLa cells, promoting oxidative damage and inducing apoptosis, especially when combined with 5-Fluorouracil (5-FU). In contrast, callus extracts exhibited a mode of action similar to pure Mistletoe Lectin I (ML-I) and demonstrated different cytotoxic effects. Moreover, the cytotoxic effects of these protein extracts were tested on two breast cancer cell lines, the MCF-7 and the triple negative MDA-MB-231, revealing significant impact on cell proliferation, particularly when used in conjunction with 5-FU. These findings have the potential to uncover new bioactive products with pharmaceutical relevance and enhance our understanding of the biochemical pathways involving mistletoe proteins in cancer treatment.