Μελέτη της παραγωγής Η2 από κυανοβακτήρια

Abstract

Το υδρογόνο (H) είναι το πιο κοινό χημικό στοιχείο στο σύμπαν, ωστόσο στην αέρια κατάσταση (H2) υπάρχει σε ελάχιστες ποσότητες στη γήινη ατμόσφαιρα. Το H2 αποτελεί ένα άχρωμο, άοσμο και μη τοξικό καύσιμο, η καθαρή καύση του οποίου παράγει μόνο νερό (Η2Ο). Ήδη από τα τέλη του 20ού αιώνα, η μετάβαση σε μία οικονομία βασισμένη στο υδρογόνο προτείνεται ως λύση απέναντι στις περιβαλλοντικές και ενεργειακές προκλήσεις που αντιμετωπίζει η ανθρωπότητα. Η αξιοποίηση της ηλιακής ενέργειας για τη βιολογική παραγωγή H₂ αποτελεί μια ιδιαίτερα υποσχόμενη οδό σε αυτή την κατεύθυνση. Τα κυανοβακτήρια είναι οι πρώτοι φωτοσυνθετικοί οργανισμοί που υιοθέτησαν την οξυγονική φωτοσύνθεση, γνωστοί για την ανθεκτικότητά τους σε ακραίες περιβαλλοντικές συνθήκες και ευρέως χρησιμοποιούμενοι σε βιοτεχνολογικές εφαρμογές, ακόμη και ως «κύτταρα-εργοστάσια» για την παραγωγή H₂. Ένα μονοκύτταρο κυανοβακτήριο του γλυκού νερού, το Synechococcus elongatus PCC7942 (στέλεχος PAMCOD), έχει αποδειχθεί ικανό να παράγει H₂ μέσω μιας διαδικασίας δύο σταδίων. Σε πρώτο στάδιο, το PAMCOD συσσωρεύει ως φωτοσυνθετικό προϊόν σακχαρόζη υπό καταπόνηση αλατότητας, και σε δεύτερο στάδιο, μέσω της αναερόβιας ζύμωσης της σακχαρόζης παράγει H₂ στο σκοτάδι (Vayenos et al., 2020). Στο στέλεχος αυτό η σακχαρόζη αποτελεί τον κύριο συμβατό ωσμωλύτη σε καταπόνηση αλατότητας . Κατά τη σκοτεινή αναερόβια ζύμωση, η συσσωρευμένη σακχαρόζη υδρολύεται από την ενδογενή ιμβερτάση και χρησιμοποιείται ως πηγή άνθρακα για την παραγωγή H₂ σε μια αμφίδρομη αντίδραση που καταλύει η [NiFe]-υδρογενάση. Ο χρονικός διαχωρισμός της παραγωγής σακχαρόζης με απελευθέρωση Ο2 στο φως και της παραγωγής H₂ στο σκοτάδι, διασφαλίζει τις ανοξικές συνθήκες που απαιτούνται για την δραστηριότητα της υδρογενάσης. Για τη βελτίωση της παραγωγής H₂ μέσω της διαδικασίας που προαναφέρθηκε, αρχικά προκαλέσαμε την αύξηση της συσσώρευσής της ως ωσμωλύτη στα κύτταρα PAMCOD. Ο συνδυασμός καταπόνησης υψηλής θερμοκρασίας (35°C) και αλατότητας (0.4 Μ NaCl) προκάλεσε αύξηση της συγκέντρωσης της σακχαρόζης (κατά 50%). Στη συνέχεια, προσδιορίστηκε το βέλτιστο pH για τη δραστικότητα των ενζύμων στη σκοτεινή ζύμωση. Η πλήρης διάσπαση της σακχαρόζης από την ιμβερτάση του PAMCOD επιτεύχθηκε σε pH 7.5, και η παραγωγή H₂ αυξήθηκε από 2 nmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1 (Vayenos et al., 2020) σε 23 nmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1. Το Synechocystis sp. PCC6714, ένα άλλο μονοκύτταρο κυανοβακτήριο του γλυκού νερού, μελετήθηκε και αυτό ως προς την ικανότητά του να συσσωρεύει σακχαρόζη κατά τη φωτοσύνθεση για να ανταπεξέλθει στην αλατότητα και τις υψηλές θερμοκρασίες. Επιπλέον, είναι γνωστό πως διαθέτει τα απαραίτητα ένζυμα (μια αλκαλική/ουδέτερη ιμβερτάση και μια αμφίδρομη [NiFe]-υδρογενάση), για την παραγωγή H₂ μέσω της σκοτεινής ζύμωσης. Η βελτιωμένη μέθοδος παραγωγής H₂ από το PAMCOD, εφαρμόστηκε και στο στέλεχος Synechocystis sp. PCC6714, με παραπλήσια αποτελέσματα. Με το συνδυασμό των καταπονήσεων αλατότητας (0.4 Μ NaCl) και υψηλής θερμοκρασίας (35°C) στο Synechocystis sp. PCC6714 παρατηρήθηκε σημαντική αύξηση στη συγκέντρωση της ενδοκυτταρικής σακχαρόζης (κατά 108%). Κατά τη διάρκεια της σκοτεινής αναερόβια ζύμωσης, η πλήρης διάσπαση της σακχαρόζης από την ιμβερτάση του Synechocystis sp. PCC6714 επιτεύχθηκε σε pH 8, αποδίδοντας 22 nmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1. Παρότι τα κυανοβακτήρια έχουν την ικανότητα να συσσωρεύουν σημαντικές ποσότητες σακχαρόζης, ο βασικός αποθηκευτικός τους υδατάνθρακας είναι το γλυκογόνο. Γι’ αυτό το λόγο, το ενδοκυτταρικό γλυκογόνο χρησιμοποιήθηκε μαζί με τη σακχαρόζη ως υπόστρωμα για την παραγωγή H₂ κατά τη σκοτεινή ζύμωση του PAMCOD. Η αποδόμηση του γλυκογόνου στα κύτταρα, πραγματοποιήθηκε απουσία αζώτου από το θρεπτικό μέσο της ζύμωσης. Η διάσπαση του ενδοκυτταρικού γλυκογόνου ενίσχυσε σημαντικά την παραγωγή H₂ από το PAMCOD (6.55 μmol H₂ h-1·mg Chlα-1), διατηρώντας παράλληλα τη δομική ακεραιότητα της φωτοσυνθετικής συσκευής. Η προσέγγιση αυτή παρουσίασε 10.000 φορές μεγαλύτερη απόδοση σε σύγκριση με τη μέθοδο των Vayenos et al. (2020), καθιστώντας το στέλεχος PAMCOD έναν από τους πιο ικανούς οργανισμούς για την παραγωγή H₂. Η βιωσιμότητα των δύο μεθόδων που εφαρμόστηκαν και στα δύο στελέχη, επιβεβαιώθηκε με την επιτυχή αναγέννηση της κυανοβακτηριακής βιομάζας μετά τις σκοτεινές ζυμώσεις σε θρεπτικά μέσα ανάπτυξης εμπλουτισμένα με νιτρικά άλατα. Τα στελέχη PAMCOD και Synechocystis sp. PCC6714, μέσω της φωτοσυνθετικής δέσμευσης ατμοσφαιρικού CO2, μπορούν να χρησιμοποιηθούν εκτός των περιορισμένων πηγών γλυκού νερού ως ανανεώσιμες πηγές H₂, με ελάχιστες ανάγκες καλλιέργειας (θρεπτικά συστατικά, ένταση φωτισμού και ανανέωση).

Hydrogen (H) is the most common chemical element in the universe, yet it exists in minute quantities in the Earth's atmosphere in its gaseous state (H2). H2 is a colourless, odourless and non-toxic fuel, the combustion of which produces only water (H2O). Already since the end of the 20th century, the transition to an H2-based economy has been proposed as a solution to the environmental and energy challenges that humanity is facing. Employing solar energy for the biological production of H₂ is a highly promising pathway to this direction. Cyanobacteria are the first photosynthetic organisms on Earth, known for their resistance to extreme environmental conditions and are widely used in biotechnological applications, even as "cell factories" for hydrogen production. A single-celled freshwater cyanobacterium, Synechococcus elongatus PCC7942 (strain PAMCOD), has recently been shown to be capable of hydrogen production through a 2-step process. In the first stage, it accumulates sucrose by photosynthesis under salinity stress, and in the second stage, it produces hydrogen via dark fermentation of sucrose (Vayenos et al., 2020). During photosynthesis, sucrose is synthesized in PAMCOD cells as the main compatible osmolyte under salinity stress. During dark anaerobic fermentation, the accumulated sucrose is hydrolyzed by endogenous invertase and used as a carbon source for hydrogen production by endogenous bi-directional [NiFe]-hydrogenase. The temporal separation of O2-emmiting sucrose production in the light and H2 production in the dark anaerobic fermentation, ensures the anoxic conditions required for the hydrogenase activity. To improve hydrogen production via dark fermentation of sucrose, we first induced an increase in its accumulation as an osmolyte in PAMCOD cells. By inducing high-temperature stress (35°C) in addition to the salinity stress (0.4 M NaCl) during photosynthesis, a significantly higher accumulation of sucrose (by 50%) was observed. The optimum pH for enzyme activity in dark fermentation was then determined. Complete sucrose breakdown by PAMCOD invertase was achieved at pH 7.5 and H₂ production increased from 2 nmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1 (Vayenos et al., 2020) to 23 nmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1. Synechocystis sp. PCC6714, another unicellular freshwater cyanobacterium, is also capable of accumulating sucrose during photosynthesis when coping with salinity and high temperatures. In addition, it possesses the necessary enzymes (an alkaline/neutral invertase and a bi-directional [NiFe]-hydrogenase) for the production of hydrogen in dark anaerobic fermentation. The improved method of hydrogen production from PAMCOD was applied also to Synechocystis sp. strain PCC6714, and revealed its similar ability for H₂ synthesis. By combining salinity (0.4 M NaCl) with high-temperature (35°C) stresses, a large increase in intracellular sucrose of Synechocystis sp. PCC6714 (by 108%) was observed. In dark anaerobic fermentation, complete sucrose breakdown by Synechocystis sp. PCC6714 invertase was achieved at pH 8, yielding 22 nmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1. Although cyanobacteria have the ability to accumulate significant amounts of sucrose, their main storage hydrocarbon is glycogen. For this reason, intracellular glycogen was used together with sucrose as a substrate for the production of H₂ during the dark fermentation of PAMCOD. Degradation of glycogen in the cells was achieved by the lack of nitrogen from the fermentation nutrient. The degradation of intracellular glycogen significantly enhanced the production of H₂ by PAMCOD (6.55 μmol H₂ ·mg Chlα-1 ·h-1). This method was 10,000-fold more efficient and places the PAMCOD strain among the most capable organisms for hydrogen production. The viability of both methods on PAMCOD and Synechocystis sp. PCC6714 was confirmed by the successful regeneration of cyanobacterial biomass after dark fermentations in both double-concentrated and nitrate-enriched growth media. PAMCOD and Synechocystis sp. PCC6714 strains can be used as renewable hydrogen sources, with minimal cultivation requirements (nutrients, light, and replenishment) outside of limited freshwater sources and by sequestering atmospheric CO2.