Ανάλυση ανθεκτικότητας εχθρών καλλιεργειών (Tuta absoluta, αλευρώδης και δάκος) στα εντομοκτόνα

Abstract

Η ενασχόληση του ανθρώπινου δυναμικού της Ελλάδας με τον πρωτογενή τομέα ανέρχεται στο 11,8% σύμφωνα με τα αποτελέσματα της Έρευνας Εργατικού Δυναμικού για το πρώτο τρίμηνο του 2023 από την Ελληνική Στατιστική Αρχή (ELSTAT 2023). Σύμφωνα με τη Eurostat η Ελλάδα βρίσκεται στην 4η θέση παραγωγής κηπευτικών όπως αγγούρια, τομάτες και κολοκύθια ανάμεσα σε σημαντικές παραγωγές χώρες εντός της Ευρώπης όπως, Ισπανία, Ιταλία και Πολωνία (Eurostat 2019). Η Ευρώπη επίσης κατέχει την πρώτη θέση της παγκόσμιας ελαιοπαραγωγής με ποσοστό 70%. Η πρώτη χώρα σε παραγωγή στην Ευρώπη είναι η Ισπανία ακολουθούμενη από την Ιταλία, ενώ η Ελλάδα κατέχει την τρίτη θέση (FAOSTAT 2022). Τα έντομα-εχθροί που προσβάλλουν τις καλλιέργειες καταστρέφουν έως και το 40% των καλλιεργειών κοστίζοντας στην παγκόσμια οικονομία, απώλειες έως και 220 δισεκατομμύρια δολάρια ετησίως, σύμφωνα με τη Διεθνή Οργάνωση Τροφίμων και Γεωργίας (FAOSTAT 2023). Στο πρώτο κεφάλαιο της διατριβής παρουσιάζονται κάποια εισαγωγικά στοιχεία για την παρούσα εργασία και στο δεύτερο περιγράφονται ορισμένοι εντομολογικοί εχθροί, όπως ο υπονομευτής της τομάτας Tuta absoluta και ο αλευρώδης του καπνού Bemisia tabaci, εξαιρετικά επιβλαβή είδη για τις καλλιέργειες κηπευτικών, καθώς και είδη της οικογένειας Tephritidae, όπως ο δάκος της ελιάς Bactrocera oleae που αποτελεί μεγάλη απειλή για την παραγωγή ελαιόλαδου. Για την αντιμετώπισή τους απαιτείται εστιασμένη ανθρώπινη παρέμβαση, που επιτυγχάνεται στις περισσότερες περιπτώσεις με τη χρήση χημικών εντομοκτόνων. Η αυξημένη χρήση των φυτοπροστατευτικών ουσιών συνεπάγεται μεγάλα κόστη παραγωγής των γεωργικών προϊόντων και παράλληλα σημαντικές περιβαλλοντικές επιπτώσεις. Εκτός αυτών, όπως έχει διαπιστωθεί, η εκτεταμένη χρήση τους είναι υπεύθυνη για την ανάπτυξη ανθεκτικότητας των εντόμων στα χημικά σκευάσματα. Στο τρίτο κεφάλαιο περιγράφονται οι μελέτες μηχανισμών ανθεκτικότητας του υπονομευτή της τομάτας Tuta absoluta στη δραστική ουσία emamectin benzoate, της ομάδας των αβερμεκτινών, μετά από την πρόσφατα τεκμηριωμένη περίπτωση μειωμένης αποτελεσματικότητας σε έναν πληθυσμό θερμοκηπίου από την Ιεράπετρα Κρήτης. Η περίπτωση αυτού του πληθυσμού με ανθεκτικότητα στη συγκεκριμένη δραστική ήταν η πρώτη που διαπιστώθηκε για το T. absoluta. Το φαινόμενο της ανάπτυξης ανθεκτικότητας αξιολογήθηκε μέσω συνεχόμενων εργαστηριακών επιλογών με emamectin benzoate για οκτώ διαδοχικές γενεές και είχε ως αποτέλεσμα την αύξηση του συντελεστή ανθεκτικότητας RR κατά 60 φορές, αποτελώντας το υψηλότερο επίπεδο ανθεκτικότητας που έχει αναφερθεί στο συγκεκριμένο εντομοκτόνο. Παράλληλα, χαρακτηρίστηκε η ανθεκτικότητα του T. absoluta στη συγκεκριμένη δραστική ουσία. Η χρήση γνωστών αναστολέων ενζύμων (PBO, DEF και DEM) αποκάλυψε ότι οι P450s είχαν συνεργιστική δράση και μείωσαν την ανθεκτικότητα στο emamectin benzoate, γεγονός που υποδηλώνει πιθανή εμπλοκή της μεταβολικής ανθεκτικότητας. Η προσέγγιση RNA-seq χρησιμοποιήθηκε για τον εντοπισμό γονιδίων με διαφοροποιημένη έκφραση ανάμεσα σε ευαίσθητους και ανθεκτικούς πληθυσμούς του T. absoluta στη δραστική emamectin benzoate. Δώδεκα βιβλιοθήκες αλληλουχήθηκαν με τη χρήση της πλατφόρμας Illumina, η οποία παρήγαγε 81 Gbp, αυξάνοντας έτσι σημαντικά τον αριθμό των διαθέσιμων γονιδιωματικών πόρων για αυτό το είδος. Η de novo συναρμολόγηση του μεταγραφώματος αποτελούνταν από 549.601 contigs, ομαδοποιημένα σε 233.453 μονογονίδια. Η ανάλυση διαφορικής έκφρασης και η επικύρωση qPCR αποκάλυψαν υπερέκφραση ενός μονογονιδίου που μοιάζει με το κυτόχρωμα P450 (Clan 4), το οποίο ενδεχομένως εμπλέκεται στην ανθεκτικότητα στη δραστική emamectin benzoate, υποστηρίζοντας περαιτέρω τη συμμετοχή των P450s στον παρατηρούμενο φαινότυπο ανθεκτικότητας. Στο τέταρτο κεφάλαιο παρουσιάζονται οι μελέτες κατά τις οποίες αξιολογήθηκαν τα επίπεδα ανθεκτικότητας του αλευρώδη του καπνού Bemisia tabaci σε εύρος σκευασμάτων με διαφορετικό τρόπο δράσης. Συγκεκριμένα εκτιμήθηκαν τα επίπεδα ανθεκτικότητας έναντι των εντομοκτόνων: flupyradifurone, sulfoxaflor, cyantraniliprole, thiacloprid, thiamethoxam, pymetrozine και spiromesifen σε 22 πληθυσμούς αλευρώδη του καπνού Bemisia tabaci από την Ελλάδα μεταξύ των ετών 2017 και 2021. Χρησιμοποιήθηκαν εργαστηριακές βιοδοκιμές εμβάπτισης φύλλου τόσο σε ενήλικα άτομα, όσο και σε νύμφες, σύμφωνα με τα αναγνωρισμένα κατά IRAC πρωτόκολλα βιοδοκιμών 15 και 16 αντίστοιχα. Όλοι οι πληθυσμοί παρουσίασαν από πολύ χαμηλά επίπεδα συντελεστών ανθεκτικότητας (Resistance Ratio, RR) έως πολύ υψηλά. Σε όλες τις περιπτώσεις καταγράφηκαν χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας στο flupyradifurone (RR <18- φορές) και στο sulfoxaflor (RR <13- φορές). Ο συντελεστής ανθεκτικότητας βρέθηκε σε χαμηλά επίπεδα για το cyantraniliprole (RR <6- φορές) σε όλες τις περιπτώσεις, υποδηλώνοντας απουσία ανθεκτικότητας σε αυτήν την ένωση, με εξαίρεση έναν πληθυσμό που παρουσίασε RR: 39-φορές. Από το 2018 και μετά, τα επίπεδα ανθεκτικότητας για το spiromesifen ήταν εξαιρετικά υψηλά (RR>1500- φορές). Εξίσου, υψηλά επίπεδα ανθεκτικότητας εντοπίστηκαν σε όλες τις περιπτώσεις για τις δραστικές pymetrozine (RR> 4000- φορές) και thiacloprid (RR: 56- >3000- φορές) και σε μία περίπτωση για το thiamethoxam (RR: 398- φορές). Παράλληλα, εκτιμήθηκε η πιθανότητα αποτυχίας ελέγχου του B. tabaci. Τα χαμηλά επίπεδα ανθεκτικότητας για τα σχετικά νέα εντομοκτόνα flupyradifurone και sulfoxaflor υποδηλώνουν την απουσία διασταυρωτής ανθεκτικότητας με άλλα εντομοκτόνα. Οι πληροφορίες αυτής της μελέτης μπορούν να εφαρμοστούν στο σχεδιασμό αποτελεσματικών προγραμμάτων χημικής καταπολέμησης στο πλαίσιο ορθολογικών συστημάτων Ολοκληρωμένης Διαχείρισης Εχθρών (Integrated Pest Management - IPM). Στο πέμπτο κεφάλαιο περιγράφονται οι μελέτες στις οποίες αξιολογήθηκαν τα επίπεδα ανθεκτικότητας σε εύρος δραστικών ουσιών για το δάκο της ελιάς Bactrocera oleae με τοπικές εφαρμογές στο εργαστήριο. Παράλληλα διερευνήθηκε η αποτελεσματικότητά τους μέσω δοκιμών στον αγρό (field), αλλά και μέσω δοκιμών σε συνθήκες προσομοίωσης στο πεδίο (semi-field). Η αξιολόγηση της ανθεκτικότητας πραγματοποιήθηκε για τις δραστικές: α-cypermethrin, beta-cyfluthrin, λ-cyhalothrin, thiacloprid και dimethoate που έχουν έγκριση για την αντιμετώπιση του B. oleae στα πλαίσια του προγράμματος της δακοκτονίας. Συγκεκριμένα, για τη δοκιμή στο εργαστήριο διεξήχθησαν κλασικές βιοδοκιμές τοπικής εφαρμογής σε εύρος δόσεων. Για τη βιοδοκιμή στον αγρό πραγματοποιήθηκε δολωματικός ψεκασμός στη συνιστώμενη δόση εφαρμογής (ΣΔΕ) του κάθε σκευάσματος, σε καλυμμένα με ειδικά κλουβιά ελαιόδεντρα. Εν συνεχεία απελευθερώθηκε συγκεκριμένος αριθμός ενηλίκων εντός των κλωβών και τα επίπεδα θνησιμότητας αξιολογούνταν κάθε 24h για 120h συνολικά. Επίσης, μια άλλη μέθοδος που αφορά δοκιμές προσομοίωσης στο πεδίο διενεργήθηκε ώστε να αξιολογηθεί η συσχέτισή τους με τις εργαστηριακές δοκιμές, αλλά και τις δοκιμές αγρού. Η ανάλυση της συσχέτισης πραγματοποιήθηκε μεταξύ των τριών μεθόδων. Στο έκτο κεφάλαιο περιγράφεται ο σχεδιασμός και η εφαρμογή ενός συστήματος ολοκληρωμένης διαχείρισης (IPM) στο πεδίο, για σημαντικούς εχθρούς των κηπευτικών (Bemisia tabaci, Tuta absoluta) βάσει εργαστηριακών δεδομένων για την ανθεκτικότητα. Συγκεκριμένα, καινοτόμες "πράσινες" ουσίες αξιολογήθηκαν στο εργαστήριο παρουσιάζοντας υψηλά επίπεδα αποτελεσματικότητας. Με βάση τα επιστημονικά δεδομένα που προέκυψαν σε άλλους πειραματισμούς της διατριβής, σχεδιάστηκε ένα σύστημα ολοκληρωμένης διαχείρισης (IPM) με στόχο την αξιολόγηση της αποτελεσματικότητας των "πράσινων" ουσιών στα είδη B. tabaci σε ελεγχόμενες συνθήκες θερμοκηπίου, σε σύγκριση με το συμβατικό σύστημα αντιμετώπισης. Σε ένα υδροπονικό θερμοκήπιο τομάτας, εφαρμόστηκαν τέσσερις επαναλήψεις για κάθε σύστημα αντιμετώπισης οι οποίες διεξήχθησαν σε θαλάμους (12m2 με 12 φυτά) που είχαν προσβληθεί τεχνητά με ταυτοποιημένο ανθεκτικό πληθυσμό B. tabaci (αλλά και με το T. absoluta που εγκαταστάθηκε μόνο του). Το σύστημα IPM περιλάμβανε την εγκατάσταση των παρασιτοειδών Eretmocerus eremicus και Trichogramma achaeae, καθώς και μαζική παγίδευση με κολλητικές παγίδες. Ο πληθυσμός του αλευρώδη εκτιμήθηκε εβδομαδιαία, με βάση τον αριθμό των ενηλίκων και των νυμφών στα κορυφαία φύλλα των φυτών. Ενώ για το T. absoluta καταγραφόταν οι προνύμφες των κορυφαίων φύλλων επίσης. Για τον έλεγχο του αλευρώδη στο συμβατικό σύστημα απαιτήθηκαν συνολικά έξι εφαρμογές με εναλλαγή των εντομοκτόνων spiromesifen, thiacloprid, flupyradifurone και sulfoxaflor ενώ στο σύστημα IPM πραγματοποιήθηκαν συνολικά 11 εφαρμογές με εναλλαγή μαλτοδεξτρίνης, τερπενοειδών, φυτικών εκχυλισμάτων, λιπαρών οξέων και πυριτίου. Για τον έλεγχο του T. absoluta έγιναν εφαρμογές μόνο βιολογικών σκευασμάτων με πολύ καλά αποτελέσματα. Τα επίπεδα προσβολής του αλευρώδη ήταν συγκρίσιμα μεταξύ των δύο συστημάτων ελέγχου για διάστημα περίπου πέντε μηνών, ωστόσο προς το τέλος της εξάμηνης καλλιεργητικής περιόδου τόσο ο αριθμός των ενηλίκων, όσο και των νυμφών του αλευρώδη ήταν σημαντικά υψηλότερος στο συμβατικό σύστημα. Οι ποιοτικές παράμετροι της τομάτας αξιολογήθηκαν και ορισμένες παρουσίασαν σημαντικές διαφορές. Τα υπολείμματα βρέθηκαν κάτω από τα καθορισμένα ανώτατα όρια υπολειμμάτων της ΕΕ για όλα τα συμβατικά σκευάσματα.

According to the Hellenic Statistical Authority's Labour Force Survey for the first quarter of 2023, 11.8% of the Greek workforce is employed in the primary sector (ELSTAT 2023). Greece ranks 4th in the production of vegetables such as cucumbers, tomatoes and pumpkins among major producing countries within Europe such as Spain Italy and Poland based on Eurostat (Eurostat 2019). Europe holds the first place in global olive oil production with a share of 70%. The leading country in terms of production in Europe is Spain followed by Italy, while Greece is in third place (FAOSTAT 2022). Insect pests that attack crops destroy up to 40% of crops costing the global economy losses of up to $220 billion annually, according to the International Food and Agriculture Organization - FAOSTAT (FAOSTAT 2023). The first chapter presents some introductory information about the present study and the second describes some entomological pests, such as the tomato leafminer Tuta absoluta and the tobacco whitefly Bemisia tabaci, extremely harmful to vegetable crops, as well as species of the Tephritidae family, such as the olive fruit fly Bactrocera oleae, which pose a major threat to global olive oil production. Their control requires interventions, which is achieved in most cases by the use of chemical insecticides. The increased use of pesticides implies high costs of agricultural production and at the same time extremely significant environmental impacts. In addition, their extensive use has been found to be responsible for the development of insect resistance to many chemical formulations. In the second chapter, the resistance mechanisms of the tomato borer Tuta absoluta to the active ingredient emamectin benzoate of the avermectins mode of action were studied after the recently and first documented case of reduced efficacy in a field population from Ierapetra, Crete, in 2016 with a resistance ratio (RR: 9fold). Low or no levels of resistance against this insecticide in insect pests have been recorded previously. The phenomenon of resistance development was evaluated through subsequent laboratory selections with emamectin benzoate for eight sequential generations, resulted an increase of the RR to 60-fold, the highest resistance level reported to the particular insecticide. Hereby, I am presenting the characterization of emamectin benzoate resistance in T. absoluta. The use of known enzyme inhibitors (PBO, DEF and DEM) revealed that P450s partially synergized emamectin benzoate resistance, suggesting potential implication of metabolic resistance. RNA-seq approach was used to identify differentially expressed genes, from emamectin benzoate resistant and susceptible T. absoluta populations. Twelve libraries were sequenced using the Illumina platform, which generated 81 Gbp, thus substantially increasing the number of publicly available genomic resources for this species. The de novo transcriptome assembly consisted of 549,601 contigs, grouped in 233,453 unigenes. Differential expression analysis and qPCR validation revealed over-expression of one unigene similar to cytochrome P450 (Clan 4) potentially implicated in emamectin benzoate resistance, supporting further the involvement of P450s in the observed resistance phenotype. In the third chapter, the studies to evaluate the resistance levels of Bemisia tabaci against several insecticides (flupyradifurone, sulfoxaflor, cyantraniliprole, thiacloprid, thiamethoxam, pymetrozine and spiromesifen), using 22 populations from Greece between 2017 and 2021 are presented. Laboratory leaf – dip bioassays both in adults and nymphs, under validated IRAC bioassay methods 15 and 16 respectively were used. All populations exhibited from very low resistance ratios (RR) to high RR. Low resistance to flupyradifurone (RR <18-fold) and to sulfoxaflor (RR <13-fold) was recorded in all cases. The resistance ratio was low for cyantraniliprole (RR<6-fold) in all cases, suggesting absence of resistance to this compound, with the exception of a strain exhibited RR: 39-fold, indicating a risk for control failure. From 2018 onwards, resistance levels for spiromesifen were extremely high (RR> 1500-fold). High resistance levels were identified in all cases for pymetrozine (RR> 4000-fold) and thiacloprid (RR: 56- >3000-fold) and in one case to thiamethoxam (RR: 398-fold). A control failure likelihood of B. tabaci was assessed. The low resistance levels for the relatively new insecticides flupyradifurone and sulfoxaflor indicates the absence of cross-resistance with other insecticides. The information of this study can be directly implemented in the design of efficient chemical control programmes within the frame of rational IPM schemes. In the fourth chapter, the resistance levels to a range of active ingredients for the control of Bactrocera oleae were evaluated with topical applications in the laboratory. The evaluation of resistance was carried out for the active substances: a-cypermethrin, beta-cypermethrin, l-cyhalothrin, thiacloprid, and dimethoate which are registered for the control of B. oleae for the regional pest management scheme under the auspices of the Hellenic Ministry of Rural Development and Food. Specifically, classical bioassays of topical application in range of doses were conducted for the laboratory test. For the field bioassay, bait application was carried out at the RLR of each compound on olive trees covered with special cages. Subsequently, a specific number of adults were released within the cages and mortality levels were assessed every 24h for 120h in total. Moreover, another method involving field simulation trials (semi-field) was conducted to evaluate their correlation with laboratory trials and field tests on whole trees. Correlation analysis between the three methods is a good indication of the reliability of the new approach with semi-field tests. In the fifth chapter, the evaluation of an integrated pest management (IPM) system designed and implemented in the field for important pests of vegetables (Bemisia tabaci, Tuta absoluta) based on laboratory data is presented. Novel products based on green chemicals were evaluated under laboratory conditions exhibiting high efficacy levels. Based on scientific evidence an IPM scheme was designed aiming to evaluate the efficacy of the tested green chemicals on B. tabaci and T. absoluta under controlled greenhouse conditions, in comparison to the standard conventional control scheme. An eight-compartment hydroponic tomato greenhouse was used, where each pest control scheme was implemented in four of the compartments (12m2 with 12 plants) artificially infested with a resistant B. tabaci population, while T. absoluta established naturally. The IPM scheme included the use of the parasitoid Eretmocerus eremicus and Trichogramma achaeae as well as mass trapping. Pest status was estimated weekly, throughout the six-month cropping season, based on the number of adults per leaf and the number of nymphs on each plant top. While for T. absoluta the larvae of the top leaves were also recorded. In the conventional control scheme, a total of six applications were required alternating insecticides spiromesifen, thiacloprid, flupyradifurone and sulfoxaflor. In the IPM scheme 11 spray applications were conducted alternating maltodextrin, terpenoids, plant extracts, fatty acids, and silica. No chemical interventions were employed for the control of T. absoluta, and the results were remarkable. Pest status was comparable between the two control schemes, however towards the end of the cropping season both adults and nymphs count of B. tabaci were significantly higher in the conventional scheme. Tomato quality parameters were evaluated and some exhibited significant differences. Residues for all four compounds were below the established EU Maximum Residue Levels (MRLs).