Βελτίωση ανθεκτικότητας των κολοκυνθοειδών έναντι της μόλυνσης από τον ιό του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς με καινοτόμες προσεγγίσεις

Abstract

Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια να βελτιωθεί η ανθεκτικότητα των κολοκυθοειδών έναντι της νόσησης από τον ιό του κίτρινου μωσαϊκού της κολοκυθιάς (Zucchini yellow mosaic virus [ZYMV]). Ο ZYMV είναι ένας ιός RNA που προσβάλει σχεδόν όλα τα κολοκυνθοειδή συμπεριλαμβανομένων των έξι σημαντικότερων καλλιεργούμενων ειδών και προκαλεί σοβαρές ζημιές σε φύλλα και καρπούς, με αποτέλεσμα την υποβάθμιση της ποιότητας των προϊόντων και τη μείωση του γεωργικού εισοδήματος. Ο ZYMV είναι διαδεδομένος παγκοσμίως. Στην Ελλάδα προκαλεί σημαντικές ζημιές, κυρίως στις νότιες περιοχές, γεγονός που επιβάλλει την ανάγκη προστασίας των καλλιεργειών. Στο πρώτο κεφάλαιο γίνεται αναφορά στη σπουδαιότητα της καλλιέργειας κολοκυνθοειδών στην Ελλάδα, στα χαρακτηριστικά του ΖΥΜV και στα προβλήματα που επιφέρει στις καλλιέργειες και, τέλος, στην αξιοποίηση του μοριακού μηχανισμού της RNA παρεμβολής ή σιώπησης για να βελτιωθεί η ανθεκτικότητα των κολοκυνθοειδών. Η RNA παρεμβολή ή σιώπηση (RNA interference [RNAi] ή RNA silencing) ήταν ο μηχανισμός που χρησιμοποιήθηκε για να επιτευχθεί ο στόχος. Η RNA σιώπηση ξεκινά, όταν ανιχνευθούν δίκλωνα μόρια RNA (double stranded RNA [dsRNA]) μέσα στο φυτικό κύτταρο από τις πρωτεΐνες DCLs (Dicer-like proteins), οι οποίες τα κόβουν. Τέτοια dsRNA μόρια είναι οι ιοί κατά την αντιγραφή του νουκλεϊκού τους οξέος. Έτσι δημιουργούνται τα μικρά παρεμβάλλοντα RNA μόρια (short interfering RNA ή siRNAs), μήκους 21-25 νουκλεοτίδια, όπου η μια αλυσίδα τους, η οδηγός, ενσωματώνεται στο σύμπλοκο RISC (RNA induced silencing complex) και το οδηγούν στο mRNA ενδιαφέροντος, στην προκειμένη περίπτωση του ZYMV, το οποίο κόβει η AGO πρωτεΐνη (ARGONAUTE protein), συστατικό του RISC, παρεμποδίζοντας με αυτό τον τρόπο τη μετάφρασή του. Τα κεφάλαια 2 και 3 αναφέρονται στην προσπάθεια που έγινε για τη βελτίωση της ανθεκτικότητας της κολοκυθιάς έναντι της μόλυνσης με ZYMV. Για την προστασία της κολοκυθιάς, που αποτελεί ίσως το πιο ευάλωτο είδος μεταξύ των κολοκυνθοειδών στον ZYMV, χρησιμοποιήθηκαν δυο προσεγγίσεις, αυτή των τεχνητών μικροRNAs (amiRNAs) και αυτή των dsRNAs, εξυπηρετώντας τους περιβαλλοντικούς περιορισμούς της Ευρωπαϊκής Ένωσης, αλλά και εύκολα εφαρμόσιμες. Πιο συγκεκριμένα, στο δεύτερο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα αποτελέσματα προστασίας της κολοκυθιάς μέσω της amiRNA-βασιζόμενης ανθεκτικότητας με μη-διαγονιδιακό τρόπο. Τα amiRNAs (artificial microRNAs) είναι τεχνητά μόρια που μιμούνται τη δράση των μικροRNAs (microRNAs ή miRNAs). Τα miRNAs είναι ενδογενούς προέλευσης, μονής αλυσίδας, με μήκος 21-25 νουκλεοτίδια και είναι παράγοντες οι οποίοι ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση. Στην παρούσα εργασία επιλέξαμε το γονίδιο της HC-Pro (helper component proteinase) του ZYMV ως στόχο για να δημιουργήσουμε τέσσερα amiRNAs, δύο από τη νοηματική (sense) αλυσίδα της HC-Pro (amiZYMV_HC-115s και 1162s) και δύο από την αντινοηματική (antisense) (amiZYMV_HC-182as και 196as) χρησιμοποιώντας για την κατασκευή τους το πρωτόκολλο των Carbonell et al. (2014). Οι τέσσερεις κατασκευές εισήχθησαν σε φυτά κολοκυθιάς -ξεχωριστά η καθεμία- με αγροέγχυση. Η έκφραση τους μέσα στα φυτικά κύτταρα ήταν καθοριστική και αυτή επιβεβαιώθηκε με ή χωρίς την παρουσία του ZYMV. Για να εξακριβωθεί η δράση των κατασκευών έναντι του ZYMV πραγματοποιήθηκε μηχανική μόλυνση με τον ZYMV μια ώρα μετά την αγροέγχυση. Βρέθηκε ότι η δράση των amiRNAs περιορίζει τον πολλαπλασιασμό του ιού και το ιικό φορτίο παρέμεινε χαμηλό στα φυτά που δέχτηκαν τα amiRNAs σε σχέση με το μάρτυρα. Τις πρώτες τέσσερις ημέρες τα τέσσερα amiRNAs είχαν παρόμοια δράση στον τοπικό ιστό. 14 ημέρες μετά τη μόλυνση με ZYMV, τα ποσοστά προστασίας ήταν 16,5% για το amiZYMV_HC-115s, 19% για το amiZYMV_HC-1162s, 32% για το amiZYMV_HC-182as και 42,5% για το amiZYMV_HC-196as. Τα ποσοστά προστασίας του amiZYMV_HC-196as παρέμειναν υψηλά καθ’ όλο το χρονικό διάστημα παρατήρησης (21 ημέρες) και για το λόγο αυτό θεωρείται το πιο αποτελεσματικό amiRNA έναντι του ZYMV. Παρόμοια αποτελέσματα αποκτήθηκαν με τη χρήση ενός δεύτερου κολοκυνθοειδούς, της λούφας, ένα φυτικό είδος το οποίο, αφενός, δίνει πολύ σύντομα συμπτώματα μετά από μόλυνση του ZYMV και αφετέρου, είναι εύκολο στο χειρισμό των φύλλων κατά την αγροέγχυση. Και σε αυτή την περίπτωση το amiZYMV_HC-196as ήταν το καλύτερο. Τα ποσοστά προστασίας των amiZYMV_HC-115s και 1162s ήταν μηδαμινά έως χαμηλά (0% και 17,14%, αντίστοιχα), ενώ των amiZYMV_HC-182as και 196as ήταν ικανοποιητικά (28,5% και 31%, αντίστοιχα). Τέλος, μολύναμε φυτά Nicotiana benthamiana που είχαν τροποποιηθεί (N. benthamiana-DCL4 knockdown, [dcl4]), έτσι ώστε να είναι δυνατή η μόλυνση με ZYMV, κάτι που δεν συμβαίνει στα αγρίου τύπου N. benthamiana φυτά. Πράγματι, τα φυτά-μάρτυρες μολύνθηκαν, όχι όμως και αυτά που δέχτηκαν αγροέγχυση με το amiZYMV_HC-196as. Στο τρίτο κεφάλαιο παρουσιάζονται τα αποτελέσματα εφαρμογής νέων dsRNAs που παρήχθησαν από το γένωμα του ZYMV για την προστασία της κολοκυθιάς έναντι αυτού. Για την επαγωγή ανθεκτικότητας έναντι του ZYMV είχαν δοκιμαστεί στο παρελθόν τα dsHC-Pro και dsCP [Kaldis et al., 2018]), τα οποία στην κολοκυθιά είχαν δώσει μικρά ποσοστά προστασίας (18% και 16%, αντίστοιχα). Παρασκευάστηκαν dsRNAs από τέσσερα άλλα γονίδια του ZYMV, ήτοι P1, P3, 6k2 και VPg. Τα dsRNA «εμβόλια» (dsP1, dsP3, ds6k2-VPg και dsVPg) παρασκευάστηκαν in vitro και εφαρμόστηκαν ταυτόχρονα με τον ZYMV, όπως στην προηγούμενη μελέτη (Kaldis et al., 2018). Το dsP1 έδωσε 62% προστασία, 21% το dsP3 και από 25% για τα ds6k2-VPg και dsVPg. Το εμβόλιο dsP1 αξιολογήθηκε ως το πλέον αποτελεσματικό έναντι του ZYMV και προστάτεψε την κολοκυθιά στα ίδια επίπεδα με το amiZYMV_HC-196as, αφού έδωσε ποσοστό προστασίας 57%. Στο τέταρτο κεφάλαιο μελετήθηκαν γονίδια που εμπλέκονται στην αλληλεπίδραση του καρπουζιού με τον ZYMV, με σκοπό να προσδιοριστεί ο λειτουργικός τους ρόλος στη μόλυνση του καρπουζιού με ZYMV. Για τον εντοπισμό αυτών των γονιδίων έγινε βιοπληροφορική αναλυση των δεδομένων NGS μολυσμένης και υγιούς καρπουζιάς για τα μικρά RNAs (small RNAseq). Κατά τη βιοπληροφορική ανάλυση εντοπίστηκαν 353 miRNAs, από τα οποία 19 ήταν γνωστά σε άλλα φυτικά είδη και τα 334 νέα. Σε όλα τα miRNAs βρέθηκαν τα μήκη τους, τα πρόδρομα μόρια, ο αριθμός των αναγνώσεων, ο τόπος που χαρτογραφούνται, το χρωματόσωμα και η αλυσίδα προέλευσης. Όλα τα miRNAs της καρπουζιάς κατατέθηκαν στη βάση δεδομένων miRBase. Βρέθηκε επίσης ποια από αυτά είναι διαφορικά εκφραζόμενα και προβλέφθηκαν οι πιθανοί τους στόχοι στο γένωμα της καρπουζιάς. Επιλέχθηκαν 5 υπερεκφραζόμενα και 4 υποεκφραζόμενα miRNAs μετά τη μόλυνση με ZYMV και έγινε επιβεβαίωση της διαφορικής έκφρασης των γονιδίων-στόχων. Τα γονίδια ClaATRIP (υποεκφραζόμενο μετά από μόλυνση με ZYMV) και ClaRBOHB (υπερεκφραζόμενο μετά από μόλυνση με ZYMV), στους οποίους εστιάσαμε, μελετήθηκαν περαιτέρω αναφορικά με την εμπλοκή τους στην αλληλεπίδραση της καρπουζιάς με τον ZYMV. Πραγματοποιήθηκε παροδική σιώπηση των γονιδίων αυτών σε φυτά καρπουζιάς μέσω της τεχνολογίας VIGS (Virus Induced Gene Silencing [VIGS]) και επακόλουθη μόλυνση με τον ZYMV. Παρατηρήθηκε ότι στα φυτά με σιωπημένο το γονίδιο ClaATRIP, το ιικό φορτίο του ZYMV παρέμεινε χαμηλά. Αντίθετα, στα φυτά με σιωπημένο το γονίδιο ClaRBOHB τo ιικό φορτίο ήταν υψηλότερο σε σχέση με το μάρτυρα. Η παρατήρηση των συμπτωμάτων κίτρινου μωσαϊκού και η ποσοτικοποίηση του ιικού φορτίου του ZYMV είναι μία ισχυρή ένδειξη ότι το ClaATRIP είναι γονίδιο ευαισθησίας και το ClaRBOHB γονίδιο ανθεκτικότητας.

In this work, an attempt was made to be improved the resistance of cucurbits against the disease from Zucchini yellow mosaic virus (ZYMV). ZYMV is an RNA virus that infects almost all cucurbits including the six major species and causes severe leaf mosaic and fruit malformation, resulting in reduced product quality and quantity and lowering the farmer’s income. ZYMV is distributed worldwide. In Greece, the disease causes significant damage in the southern regions of the country, which imposes the need to protect crops. In the first chapter, it is discussed the importance of cucurbit cultivation in Greece, the characteristics of ZYMV and the problems it causes in the crops and, finally, it was referred to the exploitation of the molecular mechanism of RNA interference or silencing to improve the resistance of cucurbits. RNA interference or silencing (RNAi) was the mechanism used to achieve this goal. RNAi begins when double stranded RNA molecules (dsRNA) are detected inside the plant cell by DCLs (Dicer-like proteins), which cut them. Such dsRNA molecules could be viruses during their replication. This is how small interfering RNA molecules (short interfering RNA [siRNAs]) of 21-25 nucleotides in length are created, where one of their chains, the guide strand, is integrated into the RISC complex (RNA induced silencing complex) and lead it to the target mRNA, in our case ZYMV, which the AGO protein (ARGONAUTE protein), a component of RISC, cuts, thereby preventing its translation. Chapters 2 and 3 are referred to the effort in order to improve cucurbit resistance to ZYMV infection. Two approaches were used to protect the zucchini, that of artificial micro RNAs (amiRNAs) and of the dsRNAs. The second chapter presents the results of the protection of the zucchini, which is perhaps the most vulnerable species among cucurbits to ZYMV, in a non-transgenic way, serving the environmental restrictions of the European Union. AmiRNAs are artificial molecules that mimic the action of small RNAs (microRNAs or miRNAs). MiRNAs are endogenous, single stranded RNAs, 21-25 nucleotides in length and are derived from precursor molecules that form loops and bulges. Their role is the regulation of gene expression. In the present work the technology of amiRNAs was used as a first approach for the protection of zucchini plants. The HC-Pro gene (helper component proteinase) of ZYMV was selected to generate four amiRNAs, two from the sense strand of HC-Pro (amiZYMV_HC-115s and 1162s) and two from the antisense (amiZYMV_HC-182as and 196as) using the protocol of Carbonell et al. (2014). The four constructs were introduced into zucchini plants individually by agroinfiltration. Their expression in the zucchini plants was confirmed with or without the presence of ZYMV. To ascertain the activity of the constructs against ZYMV, the zucchini plants with ZYMV were mechanically inoculated one hour after agroinfiltration. It was demonstrated that at the first days of infection the action of amiRNAs limited virus replication and the viral load remained low in zucchini plants that received the amiRNAs. Also, during the first four days it appeared that all four amiRNAs had similar activity in the local tissue. 14 days post infection, the protection rates were 16.5% for amiZYMV_HC-115s, 19% for amiZYMV_HC-1162s, 32% for amiZYMV_HC-182as and 42.5% for amiZYMV_HC-196as. The protection rates of amiZYMV_HC-196as remained high throughout the observation period (21 days). The use of a second plant species to confirm the above results led to choose luffa, a plant indicator which gives symptoms quickly and is easy to handle during agroinfiltration. The results were confirmed in this case as well. The protection rates of amiZYMV_HC-182as and 196as were 28.5% and 31%, respectively. Finally, Nicotiana benthamiana plants that had been modified (N. benthamiana-DCL4 knockdown [dcl4]) were infected, so that ZYMV infection was possible (wild-type N. benthamiana is not a host for ZYMV). Indeed, the dcl4 plants were infected, but not those agroinfiltrated by amiZYMV_HC-196as. In the third chapter we tested four new dsRNAs against ZYMV in zucchini of the dsRNA-mediated resistance approach. DsHC-Pro and dsCP were previously tested in the laboratory and had given low protection rates, namely 18% and 16%, respectively in zucchini (Kaldis et al., 2018). The selected genes of ZYMV were: P1, P3, 6k2 and VPg. The dsRNA vaccines (dsP1, dsP3, ds6k2-VPg and dsVPg) were prepared in vitro and applied simultaneously with ZYMV as previously described (Kaldis et al., 2018). The results at 21 dpi gave 62% protection for dsP1, 21% for dsP3, and 25% for each of the ds6k2-VPg and dsVPg. The dsP1 vaccine was evaluated as the best among all dsRNA vaccines and comparable to the amiZYMV_HC-196as since it gave a protection rate of 57%. In the fourth chapter, genes involved in the interaction between watermelon and ZYMV were studied, aiming at determining their functional role in watermelon infection with ZYMV. To identify these genes, a bioinformatic analysis of the NGS data of infected and healthy watermelon was performed on small RNAs (small RNAseq). During the bioinformatic analysis, 353 miRNAs were identified, of which 19 were known in other plant species and 334 were novel. For all miRNAs it was found the length, the precursor molecules, the number of reads in the library, the locus they mapped, the chromosome(s) and the strand of origin. It was, also, found which of them were either up- or down-regulated and was predicted their potential targets in the watermelon genome. The watermelon miRNAs were deposited in the miRBase. 5 strongly upregulated and 4 strongly downregulated watermelon miRNAs after ZYMV infection were selected and the differential expression of their target genes was confirmed. The genes ClaATRIP (upregulated) and ClaRBOHB (downregulated) were further studied for their involvement in the interaction of watermelon-ZYMV. These genes were transiently silenced in watermelon plants by VIGS (Virus Induced Gene Silencing) technology and transiently silenced plants were subsequently infected with ZYMV. The disease symptoms and the quantification of ZYMV viral load strongly support the hypothesis of the ClaATRIP as a susceptible gene and ClaRBOHB as a resistant gene in watermelon-ZYMV interaction.