Incorporation of natural bioactive compounds into matrices to enhance food functionality and shelf-life

Abstract

The past decades, the scientific community has been leading the food industry to take long strides into providing new or improved products for consumers and solve issues concerning food safety, promote sustainability and result in functional products that promote consumers’ well-being beyond basic nutrition. Consumers’ demands have grown since they are more informed and alert about their health and how to promote it. Colloids have been widely used in foods to improve their texture, encapsulate and deliver bioactive compounds and improve the solubility of, mainly, oil soluble compounds in aqueous media. The main objective of the present dissertation was the preparation of edible, and functional Pickering emulsions (PEs), stabilized by particles of natural origin without the aid of any synthetic or chemical emulsifiers, such as surfactants. The role of those PEs was to carry and deliver oil soluble biologically active ingredients in aqueous based food matrices. The emulsifiers used were mainly of plant origin and they were carefully chosen so that apart from their vegan-friendly approach, they would also enrich the final products with desirable characteristics. Pickering emulsions were used as an inspiration for the systems presented in this project because of their lack of surfactants, their increased stability against coalescence and their higher oil content, which can increase the encapsulation degree. As ingredients for the preparation of colloidal particles, Pea Protein Isolate (PPI), Soy Protein Isolate (SPI), phycocyanin (PC), fungal chitosan (FC), as well as three probiotic lactic acid bacteria strains namely, Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 (Lb. fermentum ACA-DC 179), Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 87 (Lb. bulgaricus ACA-DC 87), and Streptococcus thermophilus ACA-DC 26 (S. thermophilus ACA-DC 26) were used. PC was extracted from Spirulina platensis, and it was used alongside PPI, as a co-emulsifier, natural color agent, and antioxidant molecule. The bacteria belong to the ACA-DC collection of the Laboratory of Dairy Research of the Agricultural University of Athens. The two most used edible oils in Greece, namely Extra Virgin Olive Oil (EVOO) and Sunflower Oil (SFO) were employed as the inner oil phase. As model ingredients for the encapsulation, a-tocopherol and squalene were tested. Colloidal particles of spherical shape were successfully formulated through the pH-shifting method for FC, PPI, and SPI. Ultrasonication or High-Pressure Homogenization (HPH) were used to optimize the size of the produced particles for better stability and homogeneity of the final product. Furthermore, for the preparation of the emulsions High-Shear Homogenization (HSH) alongside HPH, in the cases that was necessary, were employed to improve droplet size homogeneity, stability and protein adsorption at the water-oil interface. Both the particles used, and the resulting emulsions were fully characterized. For the PPI, SPI, and FC particles, Dynamic Light Scattering (DLS) was used for their size determination and surface charge by ζ-potential, while Freeze Fracture Transmission Electron Microscopy (FFTEM) was employed to depict their morphology. For the emulsions characterization, Static Light Scattering (SLS) was used to determine their droplet size, optical microscopy, Confocal Laser Scanning Microscopy (CLSM) and Cryogenic Scanning Electron Microscopy (Cryo-SEM) were used to structurally characterize them in terms of morphology and ingredient distribution. The resulting particles were of spherical shape and a wide size range, leading to polydisperse emulsions. Nevertheless, the emulsions were able to incorporate oil up to 30% w/w but remained stable for 15 days. PPI emulsions proved to be more stable, so PPI was chosen for further experimentation. After applying the pH-shifting technique, PPI particles were also treated with high pressure leading to smaller and monodispersed particles that increased stability of the emulsions formed. For the formation of the emulsions HSH was used alongside HPH. Oil could be fully incorporated up to 50% w/w and the droplet size decreased significantly. Thus, PC was introduced in those systems as a co-emulsifier, natural coloring agent, and antioxidant molecule. The resulting emulsions were tested macroscopically for destabilization, and microscopically to observe the oil droplets and protein rings around them using CLSM. Pendant drop tensiometry was employed to determine the effect of the proteins/particles on their own and when combined with each other. ζ-potential measurements were used as a means to examine the stability of the particles/proteins to predict the stability of the resulting emulsions. The combination of PC and PPI formed stable emulsions of blue color that were able to encapsulate the model bioactive ingredients and have antioxidant properties of their own. The antioxidant activity of the emulsions was tested by the DPPH colorimetric assay. Another interesting ingredient used in the present PhD as a particle for the stabilization of Pickering emulsion was the polymer FC. FC was able to form spherical particles in the nanoscale by pH-shifting and ultrasonication. As mentioned above, FFTEM was used for the depiction of the particles and ζ-potential measurements to measure their surface charge in different concentrations that would give an idea for their stability, hence the overall stability of the formulated emulsions. Emulsions formed successfully incorporated up to 50% w/w of oil and were stable for more than 60 days. Apart from the structural and antioxidant characteristics of the formulated Pickering emulsions, their antimicrobial activity was also tested. Two pathogenic bacteria strains were used as targets, namely, Escherichia coli (E. coli) and Staphylococcus aureus (S. aureus). It was proven that the emulsions were effective on both pathogens in two different offered doses namely, 10 and 50% v/v. In order to further functionalize the FC emulsions a novel kind of particle was formulated, a conjugate of probiotic lactic acid bacteria and FC For this reason, the three bacteria strains mentioned above (L. fermentum ACA-DC 179, L. bulgaricus ACA-DC 87, and S. thermophilus ACA-DC 26) were tested for this purpose. FC was used as the suspension medium for the bacteria and the final solution as the aqueous phase of the emulsions. The bacteria when suspended in FC solution formed bacteria-fungal chitosan conjugates (BFCs). For the conjugates preparation, no external force was applied other than the mixing resulting to their electrochemical interaction because of their opposite charge. After a series of tests including, emulsion preparation (through HSH), emulsion stability, cell viability, L. fermentum ACA-DC 179 was chosen as the most promising strain for further assessment. Initially, the interaction between FC and L. fermentum ACA-DC 179 was measured while they were in solutions on their own and in the form of BFCs by ζ-potential. They were also visualized by CLSM and so were the emulsion droplets. Additionally, the antimicrobial activity of the formulated Pickering emulsions was tested as previously described. Finally, since L. fermentum ACA-DC 179 is a microorganism with proven probiotic activities, it was examined whether it maintains this ability as conjugate and adsorbed at an oil-water interface. For this, Enzyme-Linked Immunosorbent Assays (ELISAs) and Untargeted Metabolomics were applied. It was found that not only these novel conjugates produce emulsions that remain stable for over 60 days but also have dual functionality as antimicrobial and anti-inflammatory agents. The proposed systems are novel and offer plenty of opportunities for the preparation of various carries for bioactives that at the same time have their own functional properties.

Τα τελευταία χρόνια, η επιστημονική κοινότητα έχει βοηθήσει τη βιομηχανία τροφίμων να κάνει σημαντικά βήματα στην παροχή νέων ή βελτιωμένων προϊόντων για τους καταναλωτές και να επιλύσει προβλήματα που αφορούν την ασφάλεια των τροφίμων, να προάγει τη βιωσιμότητα και να έχει ως αποτέλεσμα λειτουργικά προϊόντα που προάγουν την ευημερία των καταναλωτών πέρα από τη βασική διατροφή. Οι απαιτήσεις των καταναλωτών έχουν αυξηθεί καθώς είναι πιο ενημερωμένοι και προσεκτικοί σχετικά με την υγεία τους και πώς να την προάγουν. Τα κολλοειδή έχουν χρησιμοποιηθεί ευρέως στα τρόφιμα για να βελτιώσουν την υφή τους, να εγκλωβίσουν βιοδραστικές ενώσεις και να βελτιώσουν τη διαλυτότητα, κυρίως, των λιποδιαλυτών ενώσεων σε υδατικά μέσα. Ο κύριος στόχος της παρούσας διατριβής ήταν η παρασκευή βρώσιμων και λειτουργικών Pickering γαλακτωμάτων (PEs), σταθεροποιημένων από σωματίδια φυσικής προέλευσης χωρίς τη βοήθεια οποιωνδήποτε συνθετικών ή χημικών γαλακτωματοποιητών, όπως οι επιφανειοδραστικές ουσίες. Ο ρόλος αυτών των PE ήταν να μεταφέρουν βιολογικά ενεργά συστατικά διαλυτά σε έλαιο, σε υδατικές βάσεις τροφίμων. Οι γαλακτωματοποιητές που χρησιμοποιήθηκαν ήταν κυρίως φυτικής προέλευσης και επιλέχθηκαν προσεκτικά, ώστε εκτός από την προσέγγιση φιλική προς τους vegans, να εμπλουτίζουν και τα τελικά προϊόντα με επιθυμητά χαρακτηριστικά. Τα γαλακτώματα Pickering χρησιμοποιήθηκαν ως έμπνευση για τα συστήματα που παρουσιάζονται σε αυτό το έργο λόγω της έλλειψης επιφανειοδραστικών, της αυξημένης σταθερότητάς τους και της υψηλότερης περιεκτικότητας σε έλαιο, που μπορεί να αυξήσει την συγκέντρωση των εγκλωβισμένων βιοδραστικών. Ως συστατικά για την παρασκευή κολλοειδών σωματιδίων χρησιμοποιήθηκαν απομονωμένη πρωτεΐνη αρακά (PPI), απομονωμένη πρωτεΐνη σόγιας (SPI), φυκοκυανίνη (PC), μυκητιακή χιτοζάνη (FC), καθώς και τρία προβιοτικά στελέχη βακτηρίων γαλακτικού οξέος, συγκεκριμένα το Lactobacillus fermentum ACA-DC 179 (Lb. fermentum ACA-DC 179), το Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus ACA-DC 87 (Lb. bulgaricus ACA-DC 87) και το Streptococcus thermophilus ACA-DC 26 (S. thermophilus ACA-DC 26). Η φυκοκυανίνη απομονώθηκε από Spirulina platensis και χρησιμοποιήθηκε μαζί με την PPI ως γαλακτωματοποιητής, φυσική χρωστική ουσία και αντιοξειδωτικό μόριο. Τα βακτήρια ανήκουν στη συλλογή ACA-DC του Εργαστηρίου Γαλακτοκομίας του Γεωπονικού Πανεπιστημίου Αθηνών. Τα δύο πιο συχνά χρησιμοποιούμενα εδώδιμα έλαια στην Ελλάδα, συγκεκριμένα το εξαιρετικό παρθένο ελαιόλαδο (EVOO) και το ηλιέλαιο (SFO), χρησιμοποιήθηκαν ως η εσωτερική φάση του ελαίου. Ως εγκλωβισμένα μόρια, δοκιμάστηκαν η α-τοκοφερόλη και το σκουαλένιο. Κολλοειδή σωματίδια σφαιρικού σχήματος σχηματίστηκαν επιτυχώς μέσω της μεθόδου αλλαγής pH για τα FC, PPI και SPI. Η υπερήχηση ή η ομογενοποίηση υψηλής πίεσης (HPH) χρησιμοποιήθηκαν για τη βελτιστοποίηση του μεγέθους των παραγόμενων σωματιδίων για καλύτερη σταθερότητα και ομοιογένεια του τελικού προϊόντος. Επιπλέον, για την παρασκευή των γαλακτωμάτων χρησιμοποιήθηκαν η Ομογενοποίηση Υψηλής Ταχύτητας Διάτμησης (HSH) μαζί με την Ομογενοποίηση Υψηλής Πίεσης (HPH), όπου ήταν απαραίτητο, για να βελτιώσουν την ομοιογένεια του μεγέθους των σταγόνων, τη σταθερότητα και την προσρόφηση πρωτεΐνης στην επιφάνεια νερού-ελαίου. Τόσο τα σωματίδια που χρησιμοποιήθηκαν όσο και τα προκύπτοντα γαλακτώματα χαρακτηρίστηκαν πλήρως. Για τα σωματίδια PPI, SPI και FC, χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της Δυναμικής Σκέδασης Φωτός (DLS) για τον προσδιορισμό του μεγέθους τους και το ζ-δυναμικό για το επιφανειακό φορτίο, ενώ η Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Διέλευσης (FFTEM) χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση της μορφολογίας τους. Για την χαρακτηρισμό των γαλακτωμάτων, χρησιμοποιήθηκε Στατική Σκέδση Φωτός (SLS) για τον προσδιορισμό του μεγέθους των σταγόνων τους, μικροσκοπία οπτική, η Συνεστιακή Μικροσκοπία Σάρωσης με Λέιζερ (CLSM) και η Κρυογονική Ηλεκτρονική Μικροσκοπία Σάρωσης (Cryo-SEM) χρησιμοποιήθηκαν για τον δομικό τους χαρακτηρισμό σε όρους μορφολογίας. Τα προκύπτοντα σωματίδια είχαν σφαιρικό σχήμα και ευρύ φάσμα μεγέθους, οδηγώντας σε πολυδιεσπαρμένα γαλακτώματα. Παρόλα αυτά, τα γαλακτώματα ήταν σε θέση να ενσωματώσουν έλαιο μέχρι 30% w/w και παρέμειναν σταθερά για 15 ημέρες. Τα γαλακτώματα PPI αποδείχθηκαν πιο σταθερά, επομένως το PPI επιλέχθηκε για περαιτέρω πειραματισμούς. Μετά την εφαρμογή της αλλαγής pH, τα σωματίδια PPI υποβλήθηκαν επίσης σε υψηλή πίεση, οδηγώντας σε μικρότερα και μονοδιεσπαρμένα σωματίδια που αύξησαν τη σταθερότητα των σχηματισμένων γαλακτωμάτων. Για το σχηματισμό των γαλακτωμάτων, χρησιμοποιήθηκε η HSH μαζί με την HPH. Το έλαιο μπορούσε να ενσωματωθεί πλήρως μέχρι 50% w/w και το μέγεθος των σταγόνων μειώθηκε σημαντικά. Έτσι, η PC εισήχθη σε αυτά τα συστήματα ως γαλακτωματοποιητής, φυσική χρωστική και αντιοξειδωτικό μόριο. Τα προκύπτοντα γαλακτώματα ελέγχθηκαν μακροσκοπικά για αποσταθεροποίηση και μικροσκοπικά για την παρατήρηση των σταγόνων ελαίου και των πρωτεϊνικών δακτυλίων γύρω από αυτές χρησιμοποιώντας την CLSM. Η τεχνική pendant drop tensiometry χρησιμοποιήθηκε για να καθοριστεί η επίδραση των πρωτεϊνών/σωματιδίων στην επιφανειακή τάση νερού-ελαίου. Οι μετρήσεις ζ-δυναμικού χρησιμοποιήθηκαν ως μέσο για την εξέταση της σταθερότητας των σωματιδίων/πρωτεϊνών για να προβλεφθεί η σταθερότητα των προκύπτοντων γαλακτωμάτων. Ο συνδυασμός PC και PPI σχημάτισε σταθερά γαλακτώματα μπλε χρώματος που ήταν σε θέση να εγκλείσουν τα πρότυπα βιοενεργά συστατικά και είχαν τις δικές τους αντιοξειδωτικές ιδιότητες. Η αντιοξειδωτική δραστηριότητα των γαλακτωμάτων δοκιμάστηκε με τη μέθοδο DPPH. Ένα άλλο ενδιαφέρον συστατικό που χρησιμοποιήθηκε στην παρούσα διατριβή ως σωματίδιο για τη σταθεροποίηση των γαλακτωμάτων Pickering ήταν το πολυμερές FC. Το FC ήταν σε θέση να σχηματίσει σφαιρικά σωματίδια σε νανοκλίμακα με αλλαγή pH και υπερήχηση. Όπως αναφέρθηκε παραπάνω, η FFTEM χρησιμοποιήθηκε για την απεικόνιση των σωματιδίων και οι μετρήσεις ζ-δυναμικού για τη μέτρηση του φορτίου επιφάνειας σε διαφορετικές συγκεντρώσεις που θα έδιναν μια ιδέα για τη σταθερότητά τους, άρα και για τη συνολική σταθερότητα των σχηματισμένων γαλακτωμάτων. Τα γαλακτώματα που σχηματίστηκαν ενσωμάτωσαν επιτυχώς έως και 50% w/w έλαιο και ήταν σταθερά για πάνω από 60 ημέρες. Εκτός από τα δομικά και αντιοξειδωτικά χαρακτηριστικά των σχηματισμένων γαλακτωμάτων Pickering, δοκιμάστηκε και η αντιμικροβιακή τους δράση. Χρησιμοποιήθηκαν δύο στελέχη παθογόνων βακτηρίων ως στόχοι, συγκεκριμένα το Escherichia coli (E. coli) και το Staphylococcus aureus (S. aureus). Αποδείχθηκε ότι τα γαλακτώματα ήταν αποτελεσματικά και στα δύο παθογόνα σε δύο διαφορετικές προσφερόμενες δόσεις, δηλαδή 10 και 50% v/v. Για να αυξηθεί περαιτέρω η λειτουργικότητα των γαλακτωμάτων σταθεροποιούμενων από FC, σχηματίστηκε ένα νέο είδος σωματιδίου, ένα σύμπλοκο προβιοτικών βακτηρίων γαλακτικού οξέος και FC. Για το σκοπό αυτό, δοκιμάστηκαν τα τρία στελέχη βακτηρίων που αναφέρθηκαν παραπάνω (L. fermentum ACA-DC 179, L. bulgaricus ACA-DC 87, και S. thermophilus ACA-DC 26). Τα βακτήρια, όταν επαναιωρούνταν σε διάλυμα FC, σχημάτισαν σύμπλοκα βακτηρίων-FC (BFCs). Για την παρασκευή των συμπλόκων, δεν προσφέρθηκε επιπλέον ενέργεια πέραν της ανάμιξης, οδηγώντας σε ηλεκτροχημική αλληλεπίδραση λόγω του αντίθετου φορτίου τους. Μετά από μια σειρά δοκιμών, συμπεριλαμβανομένων της παρασκευής γαλακτώματος (μέσω HSH), της σταθερότητας του γαλακτώματος, της βιωσιμότητας των κυττάρων, επιλέχθηκε το L. fermentum ACA-DC 179 ως το πιο υποσχόμενο στέλεχος για περαιτέρω αξιολόγηση. Αρχικά, η αλληλεπίδραση μεταξύ FC και L. fermentum ACA-DC 179 μετρήθηκε ενώ ήταν σε διαλύματα μόνα τους και με τη μορφή BFCs μέσω του ζ-δυναμικού. Επίσης, απεικονίστηκαν με την CLSM, όπως και οι σταγόνες του γαλακτώματος. Επιπλέον, η αντιμικροβιακή δραστηριότητα των σχηματισμένων γαλακτωμάτων Pickering δοκιμάστηκε όπως περιγράφηκε προηγουμένως. Τέλος, δεδομένου ότι το L. fermentum ACA-DC 179 είναι ένας μικροοργανισμός με αποδεδειγμένες προβιοτικές ιδιότητες, εξετάστηκε αν διατηρεί αυτή την ικανότητα ως συζευγμένο και προσροφημένο στην επιφάνεια ελαίου-νερού. Για το σκοπό αυτό, εφαρμόστηκαν ELISAs και Μεταβολομική. Βρέθηκε ότι αυτά τα νέα συμπλοκα όχι μόνο παράγουν γαλακτώματα που παραμένουν σταθερά για πάνω από 60 ημέρες αλλά έχουν και διπλή λειτουργικότητα ως αντιμικροβιακοί και αντιφλεγμονώδεις παράγοντες. Τα προτεινόμενα συστήματα είναι καινοτόμα και προσφέρουν πλήθος ευκαιριών για την παρασκευή διάφορων φορέων για βιοενεργές ουσίες ενώ ταυτόχρονα διαθέτουν την δικιά τους λειτουργικότητα.