Η αειφόρος διαχείριση των ανανεώσιμων πόρων διαδραματίζει σημαντικό ρόλο στη μετάβαση από μία γραμμική οικονομία σε μία κυκλική και βιολογική οικονομία με αποδοτική χρήση πόρων. Η ακάθαρτη γλυκερόλη, ως κύριο παραπροϊόν των διεργασιών παραγωγής βιοντήζελ 1ης γενιάς μέσω της αντίδρασης μεθυλεστεροποίησης, αποτελεί υποσχόμενο υλικό για την παραγωγή προϊόντων προστιθέμενης αξίας με τη χρήση της Χημικής ή της Μικροβιακής Τεχνολογίας.
Στην παρούσα διδακτορική διατριβή μελετήθηκε η χρήση της ακάθαρτης γλυκερόλης ως υπόστρωμα καλλιεργειών ζυμών (σε κωνικές φιάλες και σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου) με σκοπό τη μελέτη της μικροβιακής αύξησης και της σύνθεσης πρωτογενών και δευτερογενών μεταβολικών προϊόντων. Η ανάπτυξη νέων τεχνολογιών για τη μετατροπή της ακάθαρτης γλυκερόλης σε προϊόντα υψηλής προστιθέμενης αξίας όπως πολυολών (Pol) (ερυθριτόλης-Er, μαννιτόλης-Ml, αραβιτόλης-Ara) και κιτρικού οξέος-CA στον τομέα των βιομηχανιών τροφίμων καθώς και την παραγωγή μικροβιακού λίπους ως υλικό εκκίνησης βιολογικού καυσίμου 2ης γενιάς, με τη βοήθεια της εφαρμοσμένης βιομηχανικής μικροβιολογίας, αποτελούν υποσχόμενες οδούς της έννοιας ολοκληρωμένης ανάπτυξης και παραγωγής προϊόντων βιο-οικονομίας.
Αρχικά 4 στελέχη που ανήκουν στα είδη/γένη Yarrowia lipolytica και Rhodosporidium sp. καλλιεργήθηκαν σε ακάθαρτη γλυκερόλη, υποπροϊόν της παραγωγής βιοντήζελ αρχικής συγκέντρωσης γλυκερόλης (Gly)≈50 g/L, και αρχικού λόγου C/N≈65 moles/moles, προκειμένου να αξιολογηθούν οι δυνατότητές τους ως προς την αφομοίωσή της και την παραγωγή Pol, CA, κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών και κυτταρικού λίπους. Δύο στελέχη μεταξύ αυτών, το Y. lipolytica ACA DC 5033 και το R. toruloides DSM 4444 μελετήθηκαν περαιτέρω δεδομένου ότι στην πρώτη σειρά των πειραμάτων, παρουσίασαν καλύτερα αποτελέσματα από πλευράς παραγωγής μεταβολικών προϊόντων.
Μελετήθηκε αρχικά η διεργασία εκχύλισης των λιπιδίων από την κυτταρική μάζα των μικροοργανισμών. Χρησιμοποιήθηκαν δύο μέθοδοι εκχύλισης, η «κλασσική» με διαλύτη Folch που αποτελείται από μίγμα διαλυτών χλωροφορμίου (CHCl3)-μεθανόλης (CH3OH) σε αναλογία 2:1 και η μέθοδος της «πέψης» με HCl. Για το στέλεχος R. toruloides DSM 4444 δεν παρατηρήθηκαν διαφορές με τη χρήση και των δύο μεθόδων, παρουσιάζοντας ποσοστό ολικού κυτταρικού λίπους ανά ξηρή κυτταρική μάζα (YL/DCW)≈40%, w/w. Από την άλλη πλευρά, για το στέλεχος Y. lipolytica ACA DC 5033 τα αποτελέσματα ήταν διαφορετικά με τη χρήση της μεθόδου Folch παρουσιάζοντας πολύ καλύτερη ανάκτηση, αφού με τη μέθοδο αυτή το ποσοστό απόδοσης ολικού κυτταρικού λίπους ανά ξηρή κυτταρική μάζα YL/DCW ήταν ≈50% w/w εν αντιθέσει με την χρήση της μεθόδου ΗCl όπου επετεύχθη μέγιστο ποσοστό YL/DCW≈7%, w/w. Επίσης, οι φάσεις της κύριας ισορροπημένης ανάπτυξης (τροφόφαση) και της παραγωγής δευτερογενών μεταβολιτών (ιδιόφαση) για τις ζύμες Y. lipolytica ACA DC 5033 και R. toruloides DSM 4444 καλλιεργούμενες στη γλυκερόλη (Gly≈90 g/L), προσομοιώθηκαν επιτυχώς με τη βοήθεια αριθμητικών μοντέλων. Σύγκριση των αριστοποιημένων τιμών των παραμέτρων μmax (μέγιστος ειδικός ρυθμός παραγωγής βιομάζας), Xmax (μέγιστη παραγωγή βιομάζας), YX/Gly (απόδοση σύνθεσης βιομάζας ανά καταναλισκόμενη γλυκερόλη), YL/Gly (απόδοση σύνθεσης μικροβιακού λίπους ανά καταναλισκόμενη γλυκερόλη) και YPol,CA/Gly (απόδοση σύνθεσης πολυολών και κιτρικού οξέος ανά καταναλισκόμενη γλυκερόλη) με τα πειραματικά μας δεδομένα οδήγησε επίσης στο συμπέρασμα ότι οι βελτιστοποιημένες τιμές των παραμέτρων που προήλθαν από τα μοντέλα παρουσίασαν σύγκλιση με τις πειραματικές, παρέχοντας εχέγγυα για την ακρίβεια των χρησιμοποιούμενων μοντέλων στην προτυποποίηση των βιοδιεργασιών που έλαβε χώρα.
Κατόπιν πραγματοποιήθηκε μια ενδελεχής μελέτη της φυσιολογίας του άγριου στελέχους Y. lipolytica ACA DC 5033. Αυτό το άγριου τύπου στέλεχος καλλιεργήθηκε υπό συνθήκες περιορισμού αζώτου σε πειράματα ανακινούμενων φιαλών με ακάθαρτη γλυκερόλη που χρησιμοποιήθηκε ως μοναδικό μικροβιακό υπόστρωμα θρεπτικού μέσου στο οποίο προστέθηκαν αυξανόμενες συγκεντρώσεις χλωριούχου νατρίου (NaCl). Η αύξηση των αρχικών συγκεντρώσεων Gly (≈50, 90, 120 και 150 g/L) καθώς και η αύξηση των αρχικών συγκεντρώσεων NaCl (0, 20, 40 και 60 g/L) ορίστηκαν στο μέσο στο οποίο η αρχική συγκέντρωση αζώτου (χρήση εκχυλίσματος ζύμης 1,0 g/L και πεπτόνη 2,0 g/L ως πηγές αζώτου) παρέμεινε σταθερή και παρόμοια με το πρώτο πείραμα επιλογής («screening»). Ως εκ τούτου, η επίδραση τόσο των αυξανόμενων συγκεντρώσεων γλυκερόλης και NaCl, όσο και της αυξανόμενης αρχικής μοριακής αναλογίας C/N μελετήθηκαν στη φυσιολογική συμπεριφορά του στελέχους. Όσο περισσότερο αυξανόταν η Gly, τόσο περισσότερο εμφανιζόταν η παραγωγή πολυολών. Συγκεκριμένα, με Gly≈50 g/L, παρήχθησαν Pol≈20 g/L, ενώ με Gly≈150 g/L, παρήχθησαν Pol≈92 g/L. Η συγκέντρωση της Er επίσης αυξήθηκε αξιοσημείωτα καθώς αυξάνονταν η Gly όπως και η συγκέντρωση του NaCl. Έτσι, για Gly≈120 g/L και για αρχική συγκέντρωση NaCl=0 g/L (απουσία άλατος), η Ermax ήταν =36,2 g/L και ταυτόχρονα η συγκέντρωση Pol ήταν =57,3 g/L ενώ για Gly≈120 g/L και με αρχική παρουσία NaCl=60 g/L, η Ermax ήταν =62,0 g/L και ταυτόχρονα η συγκέντρωση Pol ήταν ≈64 g/L. Για Gly≈190 g/L, και χωρίς προσθήκη NaCl, η πολύ υψηλή συγκέντρωση ερυθριτόλης =105,0 g/L (με ταυτόχρονη παραγωγή Pol≈136 g/L) καταγράφηκε ως μια από τις υψηλότερες τιμές που έχει αναφερθεί ποτέ στη διεθνή βιβλιογραφία για στελέχη άγριου τύπου. Επιπλέον, για Gly≈120 g/L και για την αρχική συγκέντρωση NaCl=60 g/L, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε μη αποστειρωμένα μέσα (με προηγούμενη υψηλή παστερίωση συνδυασμού T=85°C για 15 λεπτά), και παρήχθη σημαντική συγκέντρωση Er, συγκρίσιμη με τα προηγουμένως αποστειρωμένα θρεπτικά μέσα (Er=61,7 g/L έναντι 62,0 g/L για το ασηπτικό πείραμα). Επιπλέον, για την περαιτέρω μείωση κόστους της διαδικασίας, πραγματοποιήθηκαν πειράματα σε μέσα με Gly≈100 g/L, με προσθήκη NaCl=80 g/L, και υπό εντελώς μη ασηπτικές συνθήκες (επομένως, δεν υπήρξε καμία προηγούμενη θερμική επεξεργασία) όπου καταγράφηκε συγκέντρωση Ermax=57,5 g/L.
Ακολούθησαν δύο ζυμώσεις του στελέχους Y. lipolytica ACA DC 5033 σε βιοαντιδραστήρα διαλείποντος έργου με Gly≈100 g/L χωρίς παρουσία άλατος υπό ασηπτικές συνθήκες. Παρατηρήθηκε ότι η μείωση της ταχύτητας ανάδευσης κατά 200 rpm (από 500 rpm σε 300 rpm) εμπόδισε την ταχεία αφομοίωση της γλυκερόλης από τη ζύμη μετατοπίζοντας το μεταβολισμό της προς τη συσσώρευση Pol και κυρίως Er και Ml με μια ταυτόχρονη αύξηση του ολικού κυτταρικού λίπους σε βάρος της παραγωγής CA. Ταυτόχρονα παρατηρήθηκε διαφοροποίηση της μορφολογίας των κυττάρων της ζύμης. Ενδεικτικά σε χαμηλές στροφές ανάδευσης με κατανάλωση 91,2 g/L γλυκερόλης εντός 380 ωρών, παρήχθησαν 4,5 g/L ολικού κυτταρικού λίπους (ΥL/DCW≈40%, w/w), ενώ ταυτόχρονα ως επί το πλείστον συντέθηκαν πολυόλες (ήτοι Ml=24,7 g/L, Er=38,0 g/L, Ara=4,0 g/L και Pol=66,7 g/L) και παρήχθη μόνο 9,0 g/L CA. Εν αντιθέσει, σε υψηλές ταχύτητες ανάδευσης (επομένως, σε υψηλή συγκέντρωση διαλυμένου οξυγόνου στο μέσο) με πλήρη κατανάλωση γλυκερόλης (≈100 g/L) όπου συνέβη πολύ πιο γρήγορα (εντός 100 ωρών), περίπου 2,9 g/L ολικού κυτταρικού λίπους παράχθησαν (ΥL/DCW≈30%, w/w), ενώ συντέθηκαν χαμηλότερες ποσότητες Pol (ήτοι Ml=8,0 g/L και Er=15,1 g/L), με τον μεταβολισμό να μετατοπίζεται προς τη σύνθεση κιτρικού οξέος (CA=57 g/L).
Σε επόμενο στάδιο, ακολούθησε καλλιέργεια του μικροοργανισμού R. toruloides DSM 4444 σε υποστρώματα υψηλής συγκέντρωσης Gly (≈50 έως ≈150 g/L) και NaCl (0 έως 60 g/L), προκειμένου να αξιολογηθεί η βιοχημική του απόκριση στα ανωτέρω υποστρώματα. Συγκεκριμένα, διερευνήθηκε η αφομοίωση Gly χρησιμοποιούμενης σε Gly≈50 g/L, 90 g/L, 120 g/L και 150 g/L προς περαιτέρω εμβάθυνση των κινητικών παραγωγής κυτταρικής μάζας, ολικού κυτταρικού λίπους και κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών. Το στέλεχος στα ανωτέρω πειράματα παρουσίασε ενδιαφέρουσες τιμές απόδοσης κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών ανά ξηρή κυτταρική μάζα (YIPS/DCW %, w/w), σε σχετικά πρώιμες φάσεις ανάπτυξης όπου οι τιμές μειώνονταν καθώς προχωρούσε η ζύμωση, ενώ ταυτόχρονα αυξάνονταν οι τιμές ολικού κυτταρικού λίπους L (g/L) και το ποσοστό YL/DCW (%, w/w).
Εν συνεχεία, πραγματοποιήθηκαν και πειράματα με προσθήκη αυξημένων ποσοτήτων NaCl (σε συγκεντρώσεις 20, 40 και 60 g/L) στο υπόστρωμα και παρατηρήθηκαν φαινόμενα ανάσχεσης της μικροβιακής αύξησης καθώς οι μετρήσεις έδειξαν ότι το στέλεχος δεν μπορεί να προσαρμοστεί σε όλους τους ανωτέρω συνδυασμούς συγκέντρωσης γλυκερόλης και άλατος. Συγκεκριμένα, κατέστη δυνατή η ανάπτυξη του εν λόγω στελέχους για Gly≈50 g/L και NaCl σε συγκεντρώσεις 20, 40 και 60 g/L με μέγιστη παραγωγή ολικού κυτταρικού λίπους (Lmax)=7,4 g/L στην περίπτωση NaCl=20 g/L. Για Gly≈90 g/L και NaCl 20 g/L και 40 g/L παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη αύξηση. Η Lmax ήταν =11,2 g/L στην περίπτωση NaCl 20 g/L, ενώ απουσία NaCl και Gly≈90 g/L, η μέγιστη συγκέντρωση των λιπιδίων ήταν στα 14,9 g/L. Σε Gly≈120 g/L και παρουσία NaCl σε συγκέντρωση 20 g/L εμφανίστηκε μέγιστη παραγωγή λιπιδίων Lmax=11,1 g/L εν αντιθέσει με την καλλιέργεια συγκέντρωσης Gly≈120 g/L και απουσία NaCl όπου η παραγωγή λιπιδίων ήταν 19,1 g/L. Σε αρχικές συγκεντρώσεις άλατος >20 g/L, και για την αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης 120 g/L, η κυτταρική αύξηση η οποία έλαβε χώρα ήταν πολύ μικρή ή αμελητέα. Τέλος, σε συγκέντρωση Gly≈150 g/L μόνο απουσία NaCl επετεύχθη ανάπτυξη του στελέχους, αφού στην αναφερόμενη αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης, οποιαδήποτε παρουσία NaCl (ακόμη και αυτή των 20 g/L) δεν επέτρεψε τη μικροβιακή αύξηση. Πάντως στο πείραμα με Gly≈150 g/L και χωρίς παρουσία άλατος, παρουσιάστηκε υψηλή κυτταρική αύξηση και μέγιστη παραγωγή ολικού κυτταρικού λίπους (Lmax=20,3 g/L, με ταυτόχρονη τιμή YL/DCW=66,1%, w/w).
Ακολούθησαν πειράματα με παστεριωμένο θρεπτικό μέσο γλυκερόλης Gly≈50 g/L και παρουσία NaCl 60 g/L όπου τα αποτελέσματα ήταν σχεδόν ταυτόσημα όσον αφορά στην παραγωγή της ξηρής κυτταρικής μάζας, του ολικού κυτταρικού λίπους και των κυτταρικών ενδοπολυσακχαριτών με αυτά του αντίστοιχου πειράματος του εν λόγω στελέχους με αρχική συγκέντρωση γλυκερόλης Gly≈50 g/L και παρουσία ΝaCl συγκέντρωσης 60 g/L όπου είχε προηγηθεί αποστείρωση του θρεπτικού μέσου.
Για όλα τα ανωτέρω πειράματα τόσο για τη ζύμη Y. lipolytica ACA DC 5033 όσο και για τη ζύμη R. toruloides DSM 4444 πραγματοποιήθηκε ανάλυση της σύστασης των λιπαρών οξέων των κυτταρικών λιπιδίων κατά την πρώιμη, όψιμη και την πολύ όψιμη φάση αύξησης της εκάστοτε καλλιέργειας σε ακάθαρτη γλυκερόλη με απουσία και παρουσία άλατος και δεν παρατηρήθηκαν αξιοσημείωτες διαφορές ως προς το προφίλ των κύριων λιπαρών οξέων, με το ελαϊκό οξύ να είναι το κυρίαρχο λιπαρό οξύ, καθιστώντας τους μικροοργανισμούς ως πολύ ανταγωνιστικούς σχετικά με την παραγωγή 2ης γενιάς βιοντήζελ, χρησιμοποιώντας τη γλυκερόλη ως υλικό εκκίνησης των διεργασιών.
Συμπερασματικώς, τα στελέχη ζυμών των ειδών Y. lipolytica και R. toruloides δύνανται να χρησιμοποιηθούν ως κυτταρικά εργοστάσια ικανά να μετατρέπουν τη γλυκερόλη σε μια πληθώρα χρήσιμων μικροβιακών μεταβολιτών. Έτσι, η ακάθαρτη γλυκερόλη, το κύριο «απόβλητο» της διεργασίας παραγωγής βιοντήζελ, αποτελεί σημαντικό υπόστρωμα προς παραγωγή προϊόντων υψηλής προστιθέμενης αξίας χρησιμοποιουμένων στη βιομηχανία τροφίμων ήτοι πολυολών και κιτρικού οξέος για την περίπτωση του οσμώφιλου στελέχους Y. lipolytica ACA DC 5033 συνδυαστικά με υψηλή συγκέντρωση άλατος (με πιθανή μελλοντική χρήση θαλασσινού νερού ή άλμης ως προϊόν αφαλάτωσης). Για την περίπτωση του στελέχους R. toruloides DSM 4444 η γλυκερόλη χρησιμοποιήθηκε επιτυχώς ως υπόστρωμα προς παραγωγή ολικού κυτταρικού λίπους, το οποίο δύναται να χρησιμοποιηθεί ως υλικό εκκινήσεως βιοντήζελ 2ης γενιάς.
The sustainable management of renewable resources plays a pivotal role in the transition from a linear economy to a circular and biological economy with efficient use of bioresources. Crude glycerol, the main side product of biodiesel production processes produced through chemical or enzymatic trans-esterification reactions of fatty materials with low-molecular weight alcohols, is a promising carbon source for the production of value-added products with the use of Chemical or Microbial Technology.
The use of crude glycerol as a microbial substrate for yeast cultures was the subject of the present thesis, in cultures performed in shake flasks and in batch bioreactors, with the aim of studying the microbial physiology and the synthesis of secondary metabolic products by non-conventional yeasts growing on this substrate. In fact, the development of new technologies for the bioconversion of crude glycerol into high added value products such as polyols-Pol (erythritol-Er, mannitol-Ml, arabitol-Ara) and citric acid-CA, compounds with high importance in the food industry as well as the production of microbial lipid, a starting material amenable for the production of 2nd generation biodiesel, topics developed in this thesis, are amongst the hottest topics for a concept of integrated development and production of bio-economy products.
Initially, 4 strains belonging to the species/genera Yarrowia lipolytica and Rhodosporidium sp. were cultivated on crude glycerol, side product of biodiesel production process, with initial substrate concentration (Gly)≈50 g/L under nitrogen-limited conditions (initial molar ratio C/N≈65 moles/moles) in order to evaluate their potential for its assimilation and the production of polyols, citric acid, cellular endopolysaccharides and microbial lipids. Two strains among them, Y. lipolytica ACA DC 5033 and R. toruloides DSM 4444 were further studied because they presented better results in terms of metabolic products production. Lipid extraction process was studied for these two strains by using two different lipid extraction methods [extraction of lipid from the synthesized dry cell weight; DCW with either a mixture of chloroform/methanol 2/1 (v/v), known as «classical» method with Folch solvent or acidification of DCW, boiling and subsequent extraction with a mixture of chloroform/methanol 2/1 (v/v), known as «digest» method with HCl] and no differences were observed for the strain R. toruloides DSM 4444, showing maximum total lipid per dry cell weight (YL/DCW)≈40%, w/w. In contrast, for the strain Y. lipolytica ACA DC 5033, much higher lipid recovery was seen without the step of previous DCW acidification and boiling. Actually, with the «classical» method the maximum YL/DCW value was ≈50%, w/w in contrast to the use of the HCl method where a maximum total lipid per dry cell weight was ≈7%, w/w which makes the «classical» method with Folch solvent excellent for further analyzes for both strains.
For Y. lipolytica, low lipid accumulation occurred, while N limitation, shifted the metabolism mostly towards the secretion and synthesis of Pol. Moreover, for R. toruloides DSM 4444 and Y. lipolytica ACA DC 5033, balanced growth phase (trophophase) and idiophase (phase of synthesis of secondary metabolites) at the trials with higher Gly concentrations (≈90 g/L) were successfully simulated with the aid of a modified Velhlust model that fitted very well on the experimental data, while optimized parameter values seemed to be quite consistent. Therefore, optimized parameters values such as μmax (maximum specific biomass production rate), Xmax (maximum biomass production), YX/Gly (yield of cellular biomass synthesis vs consumed glycerol), YL/Gly (yield of microbial lipid synthesis vs consumed glycerol), YPol,CA/Gly (polyols and citric acid synthesis yield vs glycerol consumed) were found to be quite close to the experimental values, providing strong evidence of the suitability of the models that were applied in the studied bioprocesses.
In a next step, a thorough study of the physiology of the wild strain Y. lipolytica ACA DC 5033, was carried out. This wild-type non-conventional yeast strain was cultivated under nitrogen-limited conditions in shake-flask experiments with crude glycerol employed as sole microbial substrate in media in which increasing concentrations of sodium chloride (NaCl) were added. Increasing Gly concentrations (c. 50, 90, 120 and 150 g/L) and increasing initial NaCl concentrations (0, 20, 40 and 60 g/L) were set in media in which the initial nitrogen concentration (utilization of yeast extract at 1,0 g/L and peptone at 2,0 g/L as nitrogen sources) was constant and was the same as the first («screening») experiment. Therefore, the impact of both the increasing Gly and NaCl concentrations, as well as the increasing initial C/N molar ratio were studied upon the physiological behavior of the strain. The more the Gly concentration increased, the more the production of polyols occurred; i.e. at Gly≈50 g/L, total polyols Pol≈20 g/L were produced, while at Gly≈150 g/L, Pol production≈92 g/L occurred. The concentration of Er also remarkably increased as Gly concentrations increased. The same phenomenon was also observed when the concentration of NaCl increased; for instance, at Gly≈120 g/L and for initial NaCl concentration =0 g/L (therefore no salt was added), Ermax concentration was =36,2 g/L and simultaneously Pol concentration was =57,3 while at Gly≈120 g/L and for initial NaCl=60 g/L, Ermax concentration was =62,0 g/L and simultaneously Pol concentration was ≈64 g/L.
In a next approach, at Gly≈190 g/L, and without addition of NaCl, the tremendous Ermax concentration of 105,0 g/L (simultaneous Pol≈136 g/L), one of the highest values of biotechnologically produced erythritol ever reported so far in the international literature for wild-type strains, was recorded. In addition, in media with Gly≈120 g/L and for the initial NaCl concentration =60 g/L, trials under not previously sterilized media (previous high pasteurization with a combination of T=85°C for 15 min) were carried out, and significant Er production, comparable to the previously sterilized media (Er=61,7 g/L against 62,0 g/L for the aseptic experiment) occurred. Moreover, to further decrease the process cost, trials in media with Gly≈100 g/L and added NaCl=80 g/L were performed, under completely non-aseptic conditions (therefore, not any previous thermal treatment occurred) and Ermax concentration =57,5 g/L was recorded.
Two fermentations of the strain in batch bioreactors with a glycerol concentration of Gly≈100 g/L without presence of salt under aseptic conditions were also performed. It was observed that the decrease of the stirring speed by 200 rpm (from 500 rpm to 300 rpm) prevented the rapid assimilation of glycerol by the yeast shifting its metabolism towards the accumulation of Pol and mainly Er and Ml with a simultaneous increase in microbial oil at the expense of CA production. At the same time differentiation of the yeast cell morphology was observed. Indicatively, at low stirring speeds with a consumption of 91,2 g/L glycerol within 380 h, 4,5 g/L of microbial oil (lipid per dry cell weight =40%, w/w) were produced, while simultaneously mostly polyols (viz. Ml=24,7 g/L, Er=38,0 g/L and Ara=4,0 g/L; Pol=66,7 g/L) were synthesized, and only 9,0 g/L of CA were produced. In contrast, at high stirring speeds (therefore, at high dissolved oxygen tension into the medium) with complete glycerol consumption (≈100 g/L) which occurred much faster (within 100 h), around 2,9 g/L of microbial oil (lipid per dry cell weight =30%, w/w) were synthesized, while lower Pol quantities (viz. Ml=8,0 g/L and Er=15,1 g/L) were synthesized, with the metabolism being shifted towards the synthesis of citric acid (CA synthesized was =57 g/L).
In the next stage of the research, R. toruloides DSM 4444 was studied in order to evaluate the potential of the microorganism regarding its growth in substrates with high Gly and sodium chloride concentrations. The effects of increasing Gly concentrations (c. 50, 90, 120 and 150 g/L) and initial NaCl concentrations (0, 20, 40 and 60 g/L) in media were analyzed while the initial nitrogen concentration (utilization of yeast extract at 1,0 g/L and peptone at 2,0 g/L as nitrogen sources) was constant and same as the first (“screening”) experiment. Thus, the bioprocesses related to glycerol assimilation were studied with initial concentrations of ≈50 g/L, ≈90 g/L, ≈120 g/L and ≈150 g/L to further investigate the kinetics of biomass production, and biosynthesis of microbial lipid and cellular endopolysaccharides. The strain in the above tests revealed intriguing polysaccharides synthesis yield vs dry cell weight (YIPS/DCW) values in relatively early growth phases whereas interestingly these values decreased as the fermentation progressed, while simultaneously the values of total microbial lipid (L, g/L) and the percentage of total lipid per dry cell weight YL/DCW (%, w/w) significantly increased.
Tests on substrates presenting variable initial quantities of NaCl (in concentrations of 20, 40 and 60 g/L) were carried out and the effect of inhibition on microbial growth was observed as the determinations indicated that in several cases the strain could not adapt to all of the above combinations of glycerol and salt concentration. Therefore, it was possible to grow the above strain in Gly≈50 g/L and sodium chloride NaCl in concentrations of 20 g/L, 40 g/L and 60 g/L with Lmax achieved =7,4 g/L in the case with presence of NaCl at a concentration of 20 g/L. At Gly≈90 g/L and in presence of sodium chloride at concentrations 20 g/L and 40 g/L the strain could grow, and a Lmax concentration =11,2 g/L was presented in the case of presence of NaCl=20 g/L into the growth medium, while in absence of salt NaCl=0 g/L and Gly≈90 g/L (“blank” experiment, without salt addition) the Lmax concentration achieved was 14,9 g/L. At a Gly≈120 g/L and in presence of NaCl at concentration=20 g/L, Lmax concentration =11,1 g/L occurred, in contrast to the Gly≈120 g/L and in absence of salt (NaCl=0 g/L) where the significant Lmax concentration =19,1 g/L was achieved. When NaCl concentrations >20 g/L were used at Gly≈120 g/L, insignificant or even negligible growth was recorded. Moreover, at Gly≈150 g/L only in absence of NaCl growth was carried out, showing however the very high Lmax concentration=20,3 g/L and a maximum simultaneous YL/DCW=66,1%, w/w.
Finally, tests with previously pasteurized media (Gly≈50 g/L and in presence of NaCl=60 g/L) showed similar results in terms of dry cell biomass production, microbial lipid production and cellular polysaccharides synthesis with those of the corresponding test of the above strain with a Gly≈50 g/L and presence of NaCl=60 g/L in which previous sterilization of the medium had been realized.
For all the above experiments for both the yeasts Y. lipolytica ACA DC 5033 and R. toruloides DSM 4444, analysis of cellular lipid fatty acid composition was carried out during the early, the late and the very late phase growth of each culture in crude glycerol with the absence and presence of salt into the medium, and no significant differences were observed in the distribution of the main cellular fatty acids produced. The main cellular fatty acid detected was oleic acid, therefore, lipids suitable for the synthesis of 2nd generation biodiesel were produced.
In conclusion, strains of the non-conventional yeasts Y. lipolytica and R. toruloides have been employed as microbial cell factories capable to convert glycerol into a plethora of useful microbial metabolites. Crude glycerol as the main “waste” pf biodiesel production process is an essential substrate for the production of added-value products used in the food industry, namely polyols and citric acid in the case of the osmophilic strain Y. lipolytica ACA DC 5033 in combination with a high salt concentration (with possible future use of seawater or brine as a desalination product) and microbial lipids amenable to be converted into 2nd generation biodiesel in the case of R. toruloides DSM 4444 strain.
