Μελέτη του γονιδίου της πρωτεϊνης Prion σε αίγες υγιείς και με τρομώδη νόσο

Abstract

Σκοπός της παρούσας έρευνας ήταν η μελέτη του γονιδίου της πρωτεΐνης prion (Prnp γονίδιο)στις αίγες για την εύρεση πιθανών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών που να συσχετίζονταιμε την εμφάνιση ή μη της Τρομώδους Νόσου. Στόχος ήταν επίσης α) η μελέτη του Prnp γονιδίου σε αίγες των ελληνικών φυλών β) η δημιουργία ενός αξιόπιστου διαγνωστικού πρωτοκόλλου γιατην ανεύρεση "ανθεκτικών" ατόμων και γ) πρόδρομη μοριακή ταυτοποίηση και σύγκριση των απομονώσεων της παθολογικής πρωτεΐνης prion στις αίγες που εκτρέφονται εντός και εκτός Ελλάδας. Στην παρούσα έρευνα χρησιμοποιήθηκαν δείγματα πλήρους αίματος ή εφκεφαλικού ιστού από 317 αίγες για την απομόνωση του γονιδιωματικού DNA. Τα δείγματα ανήκαν σε 126 υγιείς αίγες και 68 αίγες με Τρομώδη Νόσο (που παραχωρήκαν απότο Εθνικό Εργαστήριο Αναφοράς των Μεταδοτικών Σπογγωδών Εγκεφαλοπαθειών), σε 90 βιολογικά εκτρεφόμενες αίγες της εγχώριας ελληνικής φυλής και 33 της φυλής Σκοπέλου. Για την ανάλυση αλληλουχίας DNA ολόκληρου του ανοιχτού αναγνωστικού πλαισίου του Prnp γονιδίου χρησιμοποιήθηκε η τεχνική της ηλεκτροφόρησης σε τριχοειδές. Στη συνέχεια αναπτύχηκε ένα πρωτόκολλο βασισμένο στην ηλεκτροφόρηση πηκτής με διαβαθμισμένη αποδιατακτική σύσταση (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis- DGGE), σε συνδυασμό με τη δοκιμή της αλυσιδωτής αντίδρασης της πολυμεράσης (Polymerase Chain Reaction –PCR) και την ανάλυση πολυμορφισμών μήκους τεμαχίων περιορισμού (Restriction Fragment Length Polymorphisms-RFLP) ή PCR-RFLP. Ενώ για τη μοριακή ταυτοποίηση και σύγκριση 15 απομονώσεων της παθολογικής πρωτεΐνης prion στις αίγες χρησιμοποιήθηκε η δοκιμή της ανοσοκαθήλωσης (western blot) με τη χρήση των μονοκλωνικών αντισωμάτων P4 και SAF84. Από τις παραπάνω αναλύσεις βρέθηκαν σημειακές μεταλλάξεις, που συνεπάγονταν αντικατάσταση αμινοξέος σε συνολικά 16 κωδικόνια και σιωπηλές μεταλλάξεις σε 3 κωδικόνια. Από αυτές, 4 λειτουργικές και μία σιωπηλή μετάλλαξη παρατηρήθηκαν για πρώτη φορά στις αίγες. Επίσης ανιχνεύθηκε μια έλλειψη 24bp μεταξύ των κωδικονίων 70-77 σε μία υγιή και 3 νοσούσες αίγες, η οποία στοιχειοθετεί για πρώτη φορά την ύπαρξη τεσσάρων οκταπεπτιδικών επαναλήψεων στο Prnp γονίδιο των αιγών. Οι συχνότητες των αλληλόμορφων και των γονοτύπων μεταξύ των δύο ομάδων αιγών διαφοροποιήθηκαν στατιστικώς μόνο για το κωδικόνιο 240 και για τις σιωπηλές μεταλλάξεις στα κωδικόνια 42 και 138 (p≤0,05). Ενώ, μια τάση για διαφοροποίηση μεταξύ των δύο ομάδων αιγών παρατηρήθηκε για το κωδικόνιο 110 και 146 (p≤0,10). Σημαντικό εύρημα της παρούσας μελέτης ήταν η ανάδειξη αποκλειστικών αλληλομόρφων και στις δύο ομάδες των αιγών. Η παρουσία αποκλειστικών αλληλομόρφων στην ομάδα των υγιών αιγών για τα κωδικόνια 110, 143, 146 και 222 πιθανά προσδίδει αυξημένη ανθεκτικότητα στην Κλασική Τρομώδη Νόσο. Οι συνδυασμένοι γονότυποι της πρωτεΐνης prion δεν διαφοροποιήθηκαν στατιστικά μεταξύ των υγιών και των νοσούσων αιγών. Ομοίως, οι δύο ελληνικές φυλές αιγών δεν εμφάνισαν διαφορές στις συχνότητες των αλληλομόρφων τους για τα πολυμορφικά κωδικόνια της πρωτεΐνης prion που μελετήθηκαν. Αναφορικά, στο πρωτόκολλο της DGGE που αναπτύχθηκε στην παρούσα διατριβή, εκτιμάται ότι μπορεί να συμβάλλει στην προκαταρκτική γονοτύπηση και κατηγοριοποίηση των δειγμάτων με βάση το κοινό πρότυπο τους (pattern). Στη συνέχεια, απαιτείται πλήρης αλληλούχηση ενός δείγματος ανά κατηγορία ώστε να αναχθεί η πληροφορία για το σύνολο των δειγμάτων της. Τέλος, η πρόδρομη μοριακή ταυτοποίηση και σύγκριση των απομονώσεων τηςπαθολογικής πρωτεΐνης prion στις αίγες της παρούσας μελέτης ανέδειξε ανοσοβιοχημικά το ίδιο στέλεχος prion μεταξύ της Ελλάδας και της Ιταλίας. Ο πλήρης χαρακτηρισμός του αναμένεται μετά την ολοκλήρωση της βιολογικής δοκιμής σε πειραματόζωα. Παρά το γεγονός ότι η παρούσα έρευνα είναι η δεύτερη στη διεθνή βιβλιογραφία σε αριθμό νοσούσων αιγών, δεν αποσαφηνίζει τη πιθανή γενετική προδιάθεση της Τρομώδους Νόσου στις αίγες. Για να γίνει αυτό, απαιτείται ακόμα μεγαλύτερος αριθμός παρατηρήσεων από αίγες με Τρομώδη Νόσο, όπως έγινε στην περίπτωση των προβάτων, ώστε να εξαχθούν κατά το δυνατόν ασφαλή συμπεράσματα.

The aim of the present study was to analyze the prion protein gene (Prnp gene) prphisms in goats and their possible association to natural Scrapie. Additionaly a) Prnp gene polymorphisms were detected and described in goats of the indigenous greek and Skopelou breed, b) the establishment of an allele-specific screening protocol for the detection of “Scrapie-resistant” goats was attempted and c) the molecular characterization of 15 Greek caprine natural Scrapie isolates and their comparison to Italian caprine Scrapie isolates was performed. Frozen brain material or EDTA-treated blood samples from 317 goats were used for genomic DNA extraction. Samples originated from 126 healthy and 68 Scrapie affected goats, were kindly provided by the Greek Reference Laboratory of Transmissible Spongiform Encephalopathies (TSE). Also samples from 90 organically reared goats of the indigenous greek breed and 33 goats of Skopelou breed were used for DNA extraction. In most samples, the entire Open Reading Frame of Prnp gene was direct-sequenced by using capillary electrophoresis. Establishment of an allele-specific screening protocol for the detection of "Scrapie-resistant” goats was based on the use of Denaturing Gradient Gel Electrophoresis-DGGE, combined with PCR-RFLP. Western blotting and treatment with P4 and SAF84 monoclonal antibodies was also used for the determination of prion protein profile from natural Scrapie affected goats. The presence of coding-point mutations in 16 polymorphic codons and silent mutations in 3 codons of ORF Prnp gene were identified. Among them 4 point mutations leading to amino-acid substitution and one silent mutation were observed for the first time. Also, a 24bp deletion between codons 70-77 in one healthy and and 3 Scrapie-affected goats recording the presence of four-octapeptide repeats in goats for the first time. Allelic and genotypic frequencies between healthy and Scrapie-affected goats differed significantly only for polymorphic codon 240 and for codons 42 and 138 where silent mutations were observed (p≤0,05). Between the two groups, a tendency to allelic frequency differentiation was observed for codons 110 and 146 (p≤0,10). Important finding of the present study was the presence of private alleles in each group of goats. Private alleles in the population of healthy goats, referring to polymorphic codons 110, 143, 146 and 222 can possibly be associated to Scrapie resistance. No significant difference in the distribution of combined prion protein genotypes between healthy and Scrapie-affected goats was found. Similarly, the allelic frequencies of prion protein polymorphic codons were not significantly different between the two greek goat breeds. DGGE protocol presented in this work allows samples grouping based on their pattern and subsequently based on their allele-specific polymorphisms, by using a relative inexpensive and less sophisticated sequencing method. Representative samples from each group could be further direct-sequenced by a reference method extrapolating data to all group's samples. All Greek caprine natural Scrapie isolates had the same typical PrP western blot profile, similar to Italian caprine classical Scrapie isolates. The prion strain typing of the Greek caprine classical Scrapie isolates remains to be clarified by the ongoing bioassay in animal models. To our knowledge, the present study compromises the second larger number of Scrapie-affected goats presented worldwide. Nevertheless, it cannot adequately elucidate the genetic susceptibility of natural classical Scrapie in goats. Larger number of observations are needed to fully describe in detail.