Ανάπτυξη νέων μεθόδων προσδιορισμού ολικής αντιοξειδωτικής ενεργότητας και εφαρμογή στο ελαιόλαδο

Abstract

Η αυτοματοποίηση των αναλυτικών μεθόδων στις μέρες μας καθίσταται αναγκαία, ώστε μεγάλος αριθμός αναλύσεων να μπορεί να διεκπεραιώνεται αξιόπιστα, σε μικρό χρόνο, ελαχιστοποιώντας την ανθρώπινη παρέμβαση. Η τεχνική της εισαγωγής δείγματος σε ροή (Flow Injection, FI) και η νεώτερη της, η τεχνική διαδοχικής εισαγωγής (Sequential Injection, SI), αποτελούν τις περισσότερο εφαρμόσιμες τεχνικές αυτοματοποίησης, διότι συνδυάζουν την τεχνολογική ανάπτυξη στους κλάδους των μικροκατασκευών και μικροϋπολογιστών με την αυξημένη συχνότητα μετρήσεων, την άμεση λήψη αποτελεσμάτων και την ελάχιστη κατανάλωση αντιδραστηρίων. Οι αναλυτές FI και SI συνδυάζουν την ευκολία στη χρήση με το μικρό κόστος, ενώ επιδέχονται εύκολα σμίκρυνση επιτρέποντας την κατασκευή φορητών αναλυτικών οργάνων. Στην παρούσα διδακτορική διατριβή αναπτύχθηκαν καινοτόμες αυτοματοποιημένες μέθοδοι για την εκτίμηση της ολικής αντιοξειδωτικής ενεργότητας (Total Antioxidant Capacity, TAC) του ελαιολάδου, βασιζόμενες στις τεχνικές FI και SI: I. Αυτοματοποιημένη μέθοδος βιοφωταύγειας (κεφάλαιο 5): Ως αρχή της μεθόδου χρησιμοποιήθηκε η οξείδωση της λουμινόλης από το υπεροξείδιο του υδρογόνου παρουσία του ενζύμου της υπεροξειδάσης (HRP) ως καταλύτη. Αποτέλεσμα της οξείδωσης αποτέλεσε η εκπομπή φωτός (βιοφωταύγεια), το οποίο ενισχύθηκε με την παρουσία p-ιωδοφαινόλης. Κλάσμα του μεθανολικού εκχυλίσματος του ελαιολάδου, το οποίο περιείχε τα υδρόφιλα αντιοξειδωτικά, αναμίχθηκε με το ρεύμα του αντιδραστηρίου εργασίας το οποίο ήταν μίγμα λουμινόλης – ενζύμου HRP – p-ιωδοφαινόλης. Η βιοφωταύγεια που παράγεται κατά την αλληλεπίδραση του αντιδραστηρίου εργασίας με το υπεροξείδιο του υδρογόνου, μειώνεται λόγω της κατανάλωσης του υπεροξειδίου του υδρογόνου από τα αντιοξειδωτικά του μεθανολικού εκχυλίσματος. Αποτέλεσμα είναι η εμφάνιση αρνητικών κορυφών στο καταγράφημα, το ύψος των οποίων είναι ανάλογο της συγκέντρωσης των αντιοξειδωτικών. Χρησιμοποιήθηκε οργανολογία συστήματος FI που αναπτύχθηκε στο εργαστήριο. Πραγματοποιήθηκε βελτιστοποίηση της μεθόδου στις ακόλουθές παραμέτρους: 1) στον αριθμό των δίαυλων του συστήματος FI, 2) στην ταχύτητα ροής, 3) στο μήκος του σπειράματος ανάμιξης και 4) στις συγκεντρώσεις των HRP, υπεροξειδίου του υδρογόνου και p-ιωδοφαινόλης. Το όριο ανίχνευσης υπολογίσθηκε σε 13 10-6 M ισοδύναμα γαλλικού οξέος, ενώ το όριο ποσοτικοποίησης σε 43 10-6 M ισοδύναμα γαλλικού οξέος. Η γραμμική περιοχή ήταν στην περιοχή συγκεντρώσεων 1,0 10-6 έως 1,0 10-4 M, ενώ η επαναληψιμότητα του συστήματος ήταν καλύτερη από 2,8% RSD (n=4). Ο ρυθμός δειγματοληψίας ήταν 180 δείγματα/ώρα. II. Αυτοματοποιημένη μέθοδος FRAP (κεφάλαιο 6): Η μέθοδος προσδιορισμού της ικανότητας των αντιοξειδωτικών να ανάγουν το Fe(III) στο σύμπλοκο σιδηρο-2,4,6, τριπυριδυλ-s-τριαζίνης (Fe(III) – TPTZ) σε Fe(II) στο αντίστοιχο σιδηρι-σύμπλοκο (Fe(II) – TPTZ) σε όξινο περιβάλλον, γνωστή στη βιβλιογραφία ως μέθοδος FRAP, τροποποιήθηκε και αυτοματοποιήθηκε σε σύστημα SI. Η μέθοδος βελτιστοποιήθηκε ως προς τις συγκεντρώσεις των Fe(III) και TPTZ, τον ενιόμενο όγκο του μεθανολικού εκχυλίσματος ελαιολάδου και την ταχύτητα ροής. Η επικύρωση της μεθόδου έγινε με προσδιορισμό του ορίου ανίχνευσης, της γραμμικότητας, της επαναληψιμότητας και της αναπαραγωγιμότητας. Το όριο ανίχνευσης προσδιορίστηκε σε 0,89 μmol ισοδύναμα FeSO4 g-1 ελαιολάδου. Η γραμμική περιοχή προσδιορίστηκε από 0,01 έως 0,2 mM με σταθερά συσχέτισης r=0,9995. H σχετική τυπική απόκλιση (RSD %) της επαναληψιμότητας και της αναπαραγωγιμότητας ήταν 0,79% (n=54) και 3,6% (n=3) αντίστοιχα. Ο ρυθμός δειγματοληψίας προσδιορίστηκε σε 90 δείγματα την ώρα. Τα αποτελέσματα κυμάνθηκαν μεταξύ 24,7 και 1162 μmol ισοδύναμα FeSO4 g-1 ελαιολάδου για τα δείγματα ελαιολάδου και από 2,8 έως 5,8 μmol ισοδύναμα FeSO4 g-1 ελαίου για δείγματα ηλιέλαιου, σογιέλαιου, αραβοσιτελαίου και σησαμελαίου. Με τη μέθοδο που αναπτύχθηκε, αποδείχθηκε ότι το ελαιόλαδο είχε το υψηλότερο αντιοξειδωτικό περιεχόμενο, ενώ τα σησαμέλαιο, αραβοσιτέλαιο, σογιέλαιο και ηλιέλαιο ακολουθούν με χαμηλότερες τιμές. Κατά την ανάλυση 54 δειγμάτων εδώδιμων ελαίων έγινε σύγκριση των αποτελεσμάτων με δοκιμασία t κατά ζεύγη, μεταξύ της αυτοματοποιημένης και της δια χειρός εκτελούμενης μεθόδου FRAP, όπου βρέθηκε ότι συσχετίζονται καλά. Οι προτεινόμενες μέθοδοι παρουσιάζουν αρκετά πλεονεκτήματα στον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ενεργότητας:  Επιτεύχθηκαν χαμηλά όρια ανίχνευσης.  Μικρός χρόνος ανάλυσης των δειγμάτων.  Ευκολία στην εφαρμογή.  Επαναληψιμότητα των αποτελεσμάτων.  Μεγάλη ταχύτητα δειγματοληψίας.  Χαμηλού κόστους φορητή οργανολογία.  Μικρή κατανάλωση αντιδραστηρίου και δείγματος. Επιπλέον, τροποποιήθηκαν και προσαρμόστηκαν για την εκτίμηση της TAC του ελαιολάδου οι μέθοδοι DPPH, ABTS και Folin-Ciocalteu (κεφάλαιο 7). Οι μέθοδοι που αναπτύχθηκαν συγκρίθηκαν μεταξύ τους κατά την ανάλυση 50 δειγμάτων εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου που προέρχονται από διαφορετικές Ελληνικές περιοχές και ποικιλίες. Προσδιορίστηκαν οι τιμές ολικής αντιοξειδωτικής ενεργότητας στο μεθανολικό εκχύλισμα και στο ολικό κλάσμα του ελαιολάδου με τη μέθοδο DPPH. Η μέθοδος τροποποιήθηκε ως προς την συγκέντρωση του διαλύματος της ρίζας, 13 μΜ έναντι 20 μΜ της πρωτότυπης μεθόδου και ως προς τις τελικές αναλογίες δείγματος/ διαλύματος DPPH. Επίσης αυξήθηκε ο χρόνος επώασης στην 1 h προκειμένου να ολοκληρωθεί η αντίδραση των αντιοξειδωτικών με τη ρίζα. Οι τιμές της TAC στο μεθανολικό εκχύλισμα κυμάνθηκαν μεταξύ 1,29 και 9,95 mM ισοδύναμα γαλλικού οξέος Kg-1 ελαιολάδου και μεταξύ 77 και 177 mM mM ισοδύναμα γαλλικού οξέος Kg-1 ελαιολάδου στο ολικό κλάσμα. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές για όλα τα δείγματα ελαιολάδου (συντελεστές συσχέτισης: 0,98-1,000). Η ακρίβεια της μεθόδου κυμάνθηκε μεταξύ 2,2 και 3,5 % RSD στο ολικό κλάσμα και μεταξύ 7,0 και 9,9 % RSD στο μεθανολικό εκχύλισμα. Στην παρούσα εργασία, η μέθοδος ABTS τροποποιήθηκε με αλλαγή του οξειδωτικού αντιδραστηρίου από υπερθειικό κάλιο σε υπεροξείδιο του υδρογόνου και χρήση του ενζύμου υπεροξειδάση (HRP) ως καταλύτη. Μετά την ολοκλήρωση της αντίδρασης, η ογκομετρική φιάλη συμπληρώνεται με μεθανόλη. Το τελικό ποσοστό μεθανόλης στο διάλυμα της σχηματιζόμενης ρίζας ABTS●+ είναι περίπου 80%, και έτσι αναμιγνύεται πλήρως με το μεθανολικό εκχύλισμα του ελαιολάδου. Το πέρας της αντίδρασης σχηματισμού της ρίζας προσδιορίστηκε πειραματικά με μετρήσεις της απορρόφησης στα 734 nm ανά τακτά χρονικά διαστήματα μέχρι την λήψη σταθερής τιμής και βρέθηκε ότι απαιτούνται τρεις ώρες παραμονής του μίγματος των αντιδραστηρίων στο σκοτάδι. Οι τιμές ολικής αντιοξειδωτικής ενεργότητας με τη μέθοδο ABTS στο μεθανολικό εκχύλισμα του ελαιολάδου κυμάνθηκαν μεταξύ 5,42 και 22,5 mM ισοδύναμα γαλλικού οξέος Kg-1 ελαιολάδου. Οι καμπύλες βαθμονόμησης ήταν γραμμικές για όλα τα δείγματα (συντελεστές συσχέτισης: 0,99-1,000). Η επαναληψιμότητα της μεθόδου προσδιορίστηκε μεταξύ 6,9 και 9,7 % RSD. Προσδιορίστηκε το ολικό περιεχόμενο σε φαινόλες στο μεθανολικό κλάσμα του ελαιολάδου με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu, το οποίο βρέθηκε μεταξύ των τιμών 3,80 και 29,4 mM ισοδύναμα γαλλικού οξέος Kg-1 ελαιολάδου. Η μέθοδος τροποποιήθηκε ως προς το χρόνο μέτρησης των διαλυμάτων μετά την ανάμιξη των αντιδραστηρίων. Τα διαλύματα διατηρούνται στο σκοτάδι για 2 h πριν την μέτρηση αντί για 24 h όπως αναφέρει η πρωτότυπη μέθοδος. Η επαναληψιμότητα της μεθόδου προσδιορίστηκε μεταξύ των τιμών 6,4 και 8,8 % RSD. Το ολικό περιεχόμενο σε φαινόλες συγκρίθηκε με τις τιμές TAC, όπως προσδιορίστηκαν στο μεθανολικό εκχύλισμα με τις μεθόδους DPPH και ABTS. Οι συντελεστές συσχέτισης βρέθηκαν r=0,89 και r=0,69 αντίστοιχα. Η σύγκριση των αποτελεσμάτων της μεθόδου DPPH με αυτά της μεθόδου ABTS στο μεθανολικό εκχύλισμα κρίθηκε ικανοποιητική (r=0,81). Εντούτοις, οι τιμές της μεθόδου DPPH στο ολικό κλάσμα δεν παρουσίασαν σύγκριση με τις τιμές των μεθόδων DPPH, ABTS και Folin-Ciocalteu που εφαρμόστηκαν στο μεθανολικό εκχύλισμα του ελαιολάδου, λόγω της παρουσίας των λιπόφιλων αντιοξειδωτικών συστατικών στο ολικό κλάσμα των δειγμάτων. Πραγματοποιήθηκε πολυστοιχειακή ανάλυση δειγμάτων εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου από διάφορες Ελληνικές περιοχές και ποικιλίες με χρήση της τεχνικής της φασματομετρίας μαζών επαγωγικά συζευγμένου πλάσματος (ICP-MS), με σκοπό την χαρτογράφηση του Ελληνικού ελαιολάδου και την πιθανή σύγκριση των τιμών TAC με το περιεχόμενο σε ιχνοστοιχεία (κεφάλαιο 8). Τα αποτελέσματα επεξεργάστηκαν με τη στατιστική προσέγγιση της ανάλυσης των κύριων συνιστωσών (PCA), η οποία επιτρέπει την ομαδοποίηση άγνωστων δειγμάτων μετά τον έλεγχο πιθανής διαφοροποίησης των δειγμάτων γνωστών περιοχών και ποικιλιών. Η περιοχή συγκεντρώσεων των προτύπων διαλυμάτων για την βαθμονόμηση των στοιχείων της Ομάδας Α: 89Y, 111Cd, 118Sn, 139La,141Pr, 152Sm, 153Eu, 164Dy και 166Er κυμαίνεται από 1 έως 100 ng L-1, ενώ της Ομάδας Β: 25Mg, 55Mn, 57Fe, 60Ni, 66Zn και 88Sr από 0,1 έως 100 μg L-1. Τα In και Ge χρησιμοποιήθηκαν ως εσωτερικά πρότυπα αντίστοιχα. Οι σταθερές συσχέτισης r στις καμπύλες βαθμονόμησης κυμάνθηκαν από 0,997 έως 0,99998 για το σύνολο των στοιχείων. Οι ανακτήσεις κυμάνθηκαν μεταξύ 92% (166Er) και 118% (57Fe), ενώ τα όρια ποσοτικοποίησης προσδιορίστηκαν σε τιμές μεταξύ 0,011 (166Er) και 0,61 (118Sn) μg L-1 για την ομάδα Α και 0,73 (55Mn) έως 420 (57Fe) μg L-1 για την ομάδα Β. Όπως είναι αναμενόμενο οι σπάνιες γαίες, 89Y, 111Cd, 118Sn, 139La,141Pr, 152Sm, 153Eu, 164Dy και 166Er, περιέχονται στα δείγματα σε χαμηλότερα επίπεδα συγκέντρωσης εν συγκρίσει με τα υπόλοιπα μέταλλα 25Mg, 55Mn, 57Fe, 60Ni, 66Zn και 88Sr. Προσδιορίστηκε η ευαισθησία και επαναληψιμότητα της αναλυτικής διαδικασίας, συμπεριλαμβανομένης της χώνευσης των δειγμάτων. Η σχετική τυπική απόκλιση κυμάνθηκε μεταξύ 0,8% (153Eu) και 9% (25Mg). Για την διαφοροποίηση των δειγμάτων ελαιολάδου σύμφωνα με την περιοχή προέλευσης και την ποικιλία, επιλέχθηκαν τα ισότοπα των στοιχείων: 25Mg, 57Fe, 66Zn, 139La,141Pr, 153Eu και 166Er. Αν και τα αποτελέσματα όπως προσδιορίστηκαν με την εύκολη και γρήγορη αυτή μέθοδο ICP-MS, δεν συσχετίζονται με την αντιοξειδωτική ενεργότητα των δειγμάτων, αποτέλεσαν ωστόσο δεδομένα μιας πλήρους χαρτογράφησης του ελληνικού εξαιρετικά παρθένου ελαιολάδου.

The automation of analytical methods is very important as a large analytical batch can be processed with accuracy, in short time, while the human intervention is minimized. Flow injection (FI) and the newer sequential injection (SI) analysis are the most applicable automation techniques. They incorporate the technological development in both microdevices and microcomputers. The frequency of measurements is increased, data are taken directly and the consumption of reagents is minimized. The FI and SI analyzers are easy in use, portable and have low cost. In this thesis, novel automated methods for olive oil total antioxidant capacity (TAC) assessment, based on flow and sequential injection techniques, were developed: I. High throughput bioluminometric method (chapter 5): The chemistry involved was the horseradish peroxidase (HRP) catalysed oxidation of luminol by hydrogen peroxide. Oxidation results in light emission (bioluminescence) that is enhanced using p-iodophenol sensitizer. Αliquot of the olive oil extract containing hydrophilic antioxidants was merged with a luminol – HRP – p-iodophenol reagent stream. Bioluminescence resulting after merging the mixture with a hydrogen peroxide stream was suppressed upon increasing antioxidants’ concentration resulting in negative peaks due to hydrogen peroxide consumption by antioxidants. The method has been optimized on: 1) number of manifold channels, 2) flow rates, 3) coil length and 4) HRP, hydrogen peroxide and p-iodophenol concentrations, in a laboratory made analyzer. Detection limit was calculated at 13 10-6 M gallic acid equivalent, limit of quantification was 43 10-6 M gallic acid equivalent, linear range was between 1.0 10-6 and 1 10-4 M and intra laboratory precision was better than 2.8% RSD (n=4). The method is fully automated achieving a sampling rate of 180 per hour. II. High throughput sequential injection method for FRAP assessment (chapter 6): The FRAP assay that measures the ability of the antioxidant to reduce the ferric 2,4,6-tripyridyl-s-triazine salt (Fe(III) – TPTZ) to the blue colored ferrous complex (Fe(II) – TPTZ) at pH 3.6, was modified and automated in a SI system. The method has been optimized for Fe(III) and TPTZ concentration, injection volume of methanolic extract and flow rate. The proposed method was validated in terms of detection limit, linearity, repeatability and reproducibility. Detection limit was 0.89 μmol equiv. FeSO4 g-1. Linear range was 0.01-0.2 mM, r=0.9995. The relative standard deviation (RSD %) of repeatability and reproducibility were 0.79% (n=54) and 3.6% (n=3) respectively, while a sampling rate of 90 per hour was achieved. Antioxidant activities estimated by the automated method were in the range of 24.7-1162 μmol equiv. FeSO4 g-1 for olive oil samples and 2.8 - 5.8 μmol equiv. FeSO4 g-1 for sunflower, soya, corn and sesame oil. Results indicated that olive oil had the highest antioxidant content while sesame, corn, soya and sunflower oils are following with lower values. During the analysis of 54 edible oil samples, the developed SI method was compared and correlated well with the FRAP assay, using a paired t-test method. The proposed methods offer several advantages:  Low detection limits were achieved.  Short analysis time.  Simplicity: the proposed methods are simple to perform.  Repeatability and reproducibility  Analytical throughput.  Low cost portable apparatus.  Low reagent and sample consumption. The DPPH, ABTS and Folin-Ciocalteu methods were modified and applied for olive oil TAC and TPC assessment (chapter 7). The developed methods were compared during the analysis of a total of 50 extra virgin olive oil samples from different Greek regions and cultivars. Antioxidant capacities were determined in the methanolic olive oil extract and total fraction using the DPPH method. This method was modified in terms of the DPPH radical concentration (13 mM in advanced of 20 mM using in original method) and the final sample/DPPH working solution ratios. In addition, incubation time was increased at 1 hour for the completion of antioxidant and DPPH radical reaction. Antioxidant capacities in methanolic extracts were found between 1.29 and 9.95 mM equiv. of gallic acid Kg-1 olive oil, while in olive oil, TAC was between 77 and 177 mM mM equiv. of gallic acid Kg-1 olive oil. Calibration curves acquired for all olive oil samples were linear (correlation coefficients: 0.98-1.000). Precision ranged between 2.2 and 3.5 % RSD for the total fraction method and 7.0 and 9.9 % RSD for the method acquired in methanolic extract. The ABTS method was modified using hydrogen peroxide as oxidant instead of persulfate potassium, and horseradise peroxidase (HRP) enzyme as catalyst for the ABTS radical formation reaction. Three hours were required for the ABTS radical formation reaction. After reaction completion, the volumetric flask was filled with methanol. Final methanol concentration in ABTS●+ solution was 80% (v/v). This working solution was mixed with methanolic olive oil extract completely. Antioxidant capacities determined in the methanolic olive oil extract were between 5.42 – 22.5 mM equiv. of gallic acid Kg-1 olive oil. Calibration curves acquired for all olive oil samples were linear (correlation coefficients: 0.99-1.000). Precision ranged between 6.9 and 9.7 % RSD. The total phenol content was determined in methanolic olive oil fraction using the Folin-Ciocalteu method, that was found between 3.80 and 29.4 mM equiv. of gallic acid Kg-1 olive oil. The method was modified in terms of the time measurement of samples-folin reagent mixtures. Mixtures were stored in the dark for 2 hours instead of 24 hours as in manually FRAP method. Precision ranged between 6.4 and 8.8 % RSD. Total phenol content correlates with total antioxidant capacity assessed in hydrophilic fraction through the DPPH (r=0.89) and the ABTS (r=0.69) assays. The methanolic extract DPPH values correlate significantly with the ABTS values (r=0.81). However, the DPPH values for total olive oil correlate poorly with the ABTS assay, the Folin-Ciocalteu method and the DPPH assay in methanolic extract. Total phenols content shows good correlation with ABTS and DPPH values and could serve as a useful indicator for olive oil antioxidant capacity. A multi-element analysis of virgin olive oil samples from different regions and cultivars was carried out by inductively coupled plasma mass spectrometry (ICP-MS) aiming at mapping Greek olive oil and checking the probable correlation of results from multi-element analysis with TAC values (chapter 8). Data were processed by means of the chemo metric approach of Principal Component Analysis (PCA) that allows classifying unknown samples after checking possible differentiation of samples of known origin and cultivar. For the quantitative analysis, standard solutions were prepared by diluting multi-element solutions of 89Y, 111Cd, 118Sn, 139La, 141Pr, 152Sm, 153Eu, 164Dy, 166Er isotopes (Group A, 10 μg L-1) and of 25Mg, 55Mn, 57Fe, 60Ni, 66Zn, 88Sr isotopes (Group B, 100 μg L-1) The calibration range for the elements of Group A was from 1 to 100 ng L-1and for Group B was from 0.1 to 100 μg L-1. In and Ge were used as internal standards, respectively. The correlation coefficients of calibration curves were between 0.997 and 0.99998 for all elements. The isotopes 89Y, 111Cd, 118Sn, 139La, 141Pr, 152Sm, 153Eu, 164Dy, 166Er were present in samples in lower amounts than 25Mg, 55Mn, 57Fe, 60Ni, 66Zn, 88Sr. Results from recovery experiments were in the range of 92 (166Er) – 118% (57Fe). Furthermore, limits of quantification, LoQs, were in the range of 0.011 (166Er) - 0.61 (118Sn) μg L-1 for Group A elements and 0.73 (55Mn) – 420 (57Fe) μg L-1 for Group B elements. Sensitivity and reproducibility of analytical procedure, including the digestion pre-treatment of samples, were also determined. The relative standard deviation was between 0.8 (153Eu) and 9% (25Mg). For the principal component analysis 7 elements (25Mg, 57Fe, 66Zn, 139La, 141Pr, 153Eu and 166Er) were selected to differentiate extra virgin olive oils according to region and cultivar. Although trace element content did not correlate well with TAC values, the results obtained were a map of the trace element content of Greek olive oils during the analysis by this simple and rapid ICP-MS method.