Ανοσοεντοπισμός και δραστηριότητα της β-αμυλάσης και της NAD-ισοκιτρικής αφυδρογονάσης φυταρίων βαμβακιού που προήλθαν από προχειρισμό σπερμάτων σε θερμοκρασία 40oC

Abstract

Στη γεωργική πρακτική έχει παρατηρηθεί ότι η χρήση βαμβακόσπορου που έχει αποθηκευθεί για χρονικά διαστήματα μεγαλύτερα του έτους έχει μειωμένη βλαστικότητα αλλά κυρίως παράγει φυτά μειωμένης ζωτικότητας. Ο χειρισμός των σπερμάτων στους 40οC για μία ημέρα θεωρείται ότι αντιστοιχεί σε αποθήκευση του σπόρου στις συνήθεις συνθήκες για ένα έτος. Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η δραστικότητα ενός υδρολυτικού ενζύμου του κεντρικού μεταβολισμού (της β-­‐αμυλάσης) και ενός μιτοχονδριακού ενζύμου( της NAD+ εξαρτώμενης ισοκιτρικής αφυδρογονάσης) σε αρτίβλαστα βαμβακιού των οποίων τα σπέρματα δέχθηκαν επίδραση θερμοκρασίας (40οC) για 1,2,3,4 και 5 ημέρες. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές του ανοσοεντοπισμού, και του in vitro προσδιορισμού της δραστικότητας των ενζύμων τόσο σε φυσιολογικές συνθήκες ανάπτυξης όσο και σε συνθήκες καταπόνησης υψηλών θερμοκρασιών. Στις ρίζες, η β-­‐αμυλάση εντοπίστηκε στην καλύπτρα, στην επιδερμίδα καθώς και στον κεντρικό κύλινδρο. Στα υποκοτύλια, η παρουσία της πρωτεΐνης ήταν έντονη στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες. Τέλος, στις κοτύλες, υπήρχε γενικευμένο έντονο σήμα αλλά ισχυρότερο ήταν στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες. Η NAD+-­‐εξαρτώμενη ισοκιτρική αφυδρογονάση στις ρίζες εντοπίστηκε στην καλύπτρα, στην επιδερμίδα καθώς και στον κεντρικό κύλινδρο. Στα υποκοτύλια εντοπίστηκε κοντά στην επιδερμίδα και στην εξωτερική περιοχή του κεντρικού κυλίνδρου. Ενώ στις κοτύλες εντονότερο ήταν το σήμα στην περιοχή των ηθμαγγειωδών δεσμίδων και ιδιαίτερα στα αγγεία του ξύλου. Ο ανοσοεντοπισμός της β-­‐αμυλάσης σε μεμβράνη νιτροκυτταρίνης μετά από ηλεκτροφόρηση μη μετουσιωμένων πρωτεϊνικών εκχυλισμάτων κατέδειξε για την μεν β-­‐ αμυλάση, ύπαρξη τριών ηλεκτροφορητικών ζωνών (bands) που πιθανόν να σημαίνει ύπαρξη πολλών ισοτύπων του ενζύμου, ενώ για την NAD+ ισοκιτρική αφυδρογονάση δύο ηλεκτροφορητικών ζωνών. Τέλος, η in vitro δραστικότητα της β-­‐αμυλάσης στα εκχυλίσματα των ριζών, των κοτυλών καθώς και των υποκοτυλίων αυξήθηκε μετά από το χειρισμό ενώ η δραστικότητα της NAD+ ισοκιτρικής αφυδρογονάσης μειώθηκε. Αυτό πιθανόν σημαίνει μερική αποδιοργάνωση του κεντρικού μεταβολισμού αφού εξαιτίας του θερμικού χειρισμού παρατηρείται μεν αυξημένη δραστικότητα της β-­‐ αμυλάσης (που παραπέμπει σε 6 υδρόλυση του αμύλου) αλλά μείωση στη δραστικότητα της NAD+ ισοκιτρικής αφυδρογονάσης (μειωμένη μιτοχονδριακή δραστηριότητα).

In agricultural practice has been observed that the use of cottonseed stored for periods in excess of the year has reduced germination but mainly it produces plants with reduced vitality. Handling of the seeds to 40oC for one day is deemed equivalent to storing the seeds for one year in normal storing conditions. In this study, the hydrolytic activity of an enzyme of central metabolism (beta-­‐amylase) and a mitochondrial enzyme (the NAD+ dependent isocitrate dehydrogenase) in cotton seedlings whose seeds have accepted temperature impact (40oC) for 1,2,3,4 and 5 days was examined. For this purpose, we used the techniques of immunolocalization and in vitro activity assay of enzymes in both normal growth and stress conditions at high temperatures. In roots, beta-­‐amylase was detected in the hood, the skin and the central cylinder. In hypocotyls the presence of protein was marked in vascular bundles. Finally, in cotyledons, there was a generalized intense signal, but it was stronger in vascular bundles. The immunolocalization of beta-­‐amylase on nitrocellulose membrane after electrophoresis of non-­‐ denaturized protein extracts revealed the true b-­‐amylase, having five electrophoretic bands that probably mean that there are several isoforms of the enzyme, for the NAD + isocitrate dehydrogenase two electrophoretic bands were found. Finally, the in vitro activity of beta-­‐amylase in extracts of roots, the cotyledon and of hypocotyls increased after treatment, while the activity of NAD + isocitrate dehydrogenase decreased. This may mean partial disruption of the central metabolism as a result of thermal treatment because while enhanced activity of beta-­‐amylase (referring to starch hydrolysis), the activity of NAD + isocitrate dehydrogenase (decreased mitochondrial activity) is reduced.