Στις σύγχρονες καλλιέργειες υιοθετείται η λογική της Ολοκληρωμένης Αντιμετώπσης εχθρών καλλιεργειών, η οποία βασίζεται και στη χρήση ωφέλιμων οργανισμών. Η σωστή αναγνώριση και ταυτοποίηση των οργανισμών που θα χρησιμοποιηθούν, αλλά και των ίδιων των εχθρών, είναι μείζουσας σημασίας ώστε ο παραγωγός να λάβει ένα ικανοποιητικό εισόδημα και ταυτόχρονα να μη δαταραχθεί η ισορροπία του μικροπεριβάλλοντος της καλλιέργειας. Το γένος Macrolophus (Hemiptera: Miridae) περιλαμβάνει αρπακτικά έντομα που τρέφονται με αλευρώδεις, θρίπες, ακάρεα, φυλλορήκτες κα. σε θερμοκηπιακές ή υπαίθριες καλλιέργειες κηπευτικών. Για τη διάκριση των ειδών M. pygmaeus (Rambur) και M. melanotoma Costa (=M. caliginosus Wagner) χρησιμοποιείται το μορφολογικό χαρακτηριστικό του χρώματος του πρώτου άρθρου της κεραίας (μαύρο ή μαύρο με ανοιχτόχρωμη περιοχή), αλλά και το φυτό ξενιστής τους (Solanaceae ή Dittrichia sp.). Οι δύο αυτοί τρόποι, όμως, δεν είναι απόλυτα αξιόπιστοι κι έτσι είναι απαραίτητο να υπάρχουν και άλλοι μέθοδοι αναγνώρισης.
Στην παρούσα μελέτη, αξιολογήθηκαν τα μορφολογικά χαρακτηριστικά, αλλά και τα δύο φυτά ξενιστές ως προς την ικανότητά τους για διάκριση των δύο ειδών. Παράλληλα πραγματοποιήθηκαν διασταυρώσεις μεταξύ των M. pygmaeus και M. melanotoma και εξετάστηκε η πιθανότητα να δώσουν γόνιμους απογόνους. Ακόμη, εφαρμόστηκε η τεχνική του προσδιορισμού νουκλεοτιδικής αλληλουχίας (sequencing) γονιδιακών τμημάτων του μιτοχονδριακού DNA, με δύο διαφορετικούς μοριακούς δείκτες έχοντας ως στόχο τη διάκριση των ειδών.
Kατά την πειραματική διαδικασία του προσδιορισμού της νουκλεοτιδικής αλυσίδας πραγματοποιήθηκε απομόνωση ολικού DNA και αλυσιδωτή αντίδραση πολυμεράσης (PCR) με 2 ζεύγη εκκινητών που προσδιορίζουν το γονιδιακό τμήμα που ελέγχει τη σύνθεση α) της υπομονάδας Ι του συμπλόκου της κυτοχρωμικής οξειδάσης (COI) και β) της μικρής υπομονάδας του ριβοσώματος (12srDNA). Στη συνέχεια, για λόγους ελέγχου της διαδικασίας πραγματοποιήθηκε ηλεκτροφόρηση πήγματος αγαρόζης 2% και τέλος καθαρισμός των προϊόντων PCR, καθώς και προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας των ανωτέρω γονιδιακών τμημάτων μέσω της εταιρείας Macrogen. Η στατιστική επεξεργασία των αποτελεσμάτων έγινε με τα υπολογιστικά πακέτα CLUSTAL W2, Mega v. 4.0.0 και DnaSP 5.10 για να προσδιοριστεί ο αριθμός των απλοτύπων (24 για το COI και 23 για το 12sr), να υπολογισθούν οι pairwise γενετικές αποστάσεις και να κατασκευαστούν φυλογενετικά δένδρα με τις μεθόδους της ελάχιστης εξέλιξης, της μέγιστης φειδωλότητας και της Neighbour-Joining.
Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι για τη διάκριση των M. pygmaeus και M. melanotoma δεν ισχύει το μορφολογικό χαρακτηριστικό της κεραίας, αλλά το φυτό ξενιστής. Επιπλέον, απεδείχθη ότι πρόκειται για δύο διαφορετικά είδη τα οποία και οι δύο μοριακοί δείκτες που χρησιμοποιήθηκαν κατάφεραν να τα διαχωρίσουν, καθώς και να δώσουν πληροφορίες για την ύπαρξη ενδοειδικής ποικιλότητας.
In the framework of modern I.P.M., predators are used more and more and the precise identification of the beneficial organism is of high importance. In Macrolophus sp. (Hemiptera: Miridae), two species Macrolophus pygmaeus (Rambur) and Macrolophus melanotoma Costa (=M. caliginosus Wagner) are important biocontrol agents against whiteflies, aphids, mites, leafminers etc. Their discrimination, however, is difficult and based only on the color of first antenna segment and the host plant. Recently, investigations using molecular markers in order to separate these species have been done.
In this study, it is estimated the possibility of morphological characteristics and host plant to discriminate the two species. Additionally, some crossing experinments between M. pygmaeus and M. melanotoma take place, while two different mitochondrial DNA gene segments are investigated using sequencing analysis in order to detect molecular markers discriminating the above mentioned species. The first step for sequencing was the DNA extraction followed by the Polymerase Chain Reaction (PCR) where two pair of primers were used. The first one is for the the expression of the mitochondrial cytochrome oxidase subunit I gene segment (COI) and the second one for the small ribosomal subunit (12srDNA). The next step was the agarose gel electrophoresis of DNA, followed by purifying the PCR products. Moreover, individual sequences were determined via automated sequencing of both strands of each mtDNA gene segment provided by Macrogen Company.
The statistical analysis was performed using the packages CLUSTAL W2, Mega v. 4.0.0 και DnaSP 5.10. 24 and 23 haplotypes were detected for 12sr and COI gene segments respectively. The pairwise genetic distance showed that the most distant population was M. pygmaeus from Spain and M. melanotoma from Kyparissia-Greece. Additionally, maximum parsimony, minimum evolution and neighbour-joining dedrograms showed that the two species are grouped in two different clades. Moreover, the morphological characteristics checked are not sufficient for the discrimination of M. pygmaeus and M. melanotoma, while the criteria of host plant is; The molecular markers used can discriminate M. pygmaeus and M. melanotoma.
