Αξιολόγηση επιφανειοδραστικών ουσιών στην ενεργοποίηση του αμυντικού μηχανισμού της ανοσοποίησης των φυτών

Abstract

Τα φυτά κατά την μακρόχρονη εξελικτική τους πορεία διαμόρφωσαν πολύπλοκους μηχανισμούς που τους προσέδιδαν ανθεκτικότητα στην πληθώρα των παθογόνων (μύκητες, βακτήρια και ιοί) με τα οποία έρχονται σε καθημερινή επαφή. Το φαινόμενο της επίκτητης διασυστηματικής αντοχής SAR δηλαδή της βιοχημικής ή χημικής διέγερσης λανθανόντων μηχανισμών αντοχής, ώστε ένα φυτό ευπαθές σε ένα σύστημα ξενιστή-παθογόνου, να καθίσταται ανθεκτικό στο ίδιο αυτό σύστημα, αποτελεί σημείο έρευνας για πάρα πολλά χρόνια. Τα αποτελέσματα της SAR στην αντιμετώπιση ενός μεγάλου φάσματος παθογόνων, είναι συχνά τόσο ικανοποιητικά για την παρεμπόδιση και περιορισμό της ασθένειας, που έδωσαν το έναυσμα στους ερευνητές να προσπαθήσουν να αναπαράγουν το φαινόμενο ακόμα και με την απουσία των παθογόνων που αποτελούν τον παράγοντα έναρξης της επαγωγής ανθεκτικότητας. Η διάθεση στο εμπόριο σκευασμάτων με ουσίες που όταν εφαρμοσθούν στα φυτά μπορούν να επάγουν SAR, είναι πλέον γεγονός. Στα πλαίσια της παρούσας μελέτης, αξιολογήθηκαν δύο κατιονικοί επιφανειοδραστικοί παράγοντες του βρωμιούχου αμμωνίου (cationic surfactants of ammonium bromide) για την ικανότητα τους να επάγουν τον αμυντικό μηχανισμό των φυτών. Οι επιφανειοδραστικοί αυτοί παράγοντες, δεν έχουν μελετηθεί μέχρι τώρα για την ικανότητα τους να επάγουν την επίκτητη διασυστηματική αντοχή (Systemic Acquired Resistance, SAR) στα φυτά, ενώ σε άλλους οργανισμούς μελέτες έχουν δείξει ότι μπορούν να παίξουν σημαντικό ρόλο ως παράγοντες ανοσοποίησης. Στην παρούσα εργασία, μελετήθηκε η εξέλιξη των συμπτωμάτων σε τρία συστήματα αλληλεπίδρασης ξενιστή-παθογόνου, σε κάθε ένα από τα οποία είχε γίνει εφαρμογή δύο τέτοιων παραγόντων, των Α και Β, σε διαφορετικές συγκεντρώσεις, προκειμένου να διαπιστωθεί αν κάποια συγκέντρωση ενός από τους δύο παράγοντες υπερτερεί έναντι των άλλων στον περιορισμό των συμπτωμάτων της ασθένειας. Τα πειράματα παθογένειας πραγματοποιήθηκαν σε φυτά Arabidopsis thaliana που μολύνθηκαν με τον ωομύκητα Hyaloperonospora parsitica και το μύκητα Verticillium dahliae και σε φυτά καπνού, Nicotiana tabacum, που μολύνθηκαν με τον ιό ΤΜV. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα από τα πειράματα παθογένειας, με τον ωομύκητα Hyaloperonospora parsitica, η επέμβαση με τον παράγοντα Α σε συγκέντρωση 10 mM, έδωσε πολύ καλύτερα αποτελέσματα σε σχέση με το μάρτυρα και τις άλλες επεμβάσεις μειώνοντας τα επίπεδα της ασθένειας κατά 50%. Στα πειράματα παθογένειας με το παθογόνο Verticillium dahliae, για την αξιολόγηση της δυνατότητας των δύο παραγόντων Α και Β να περιορίσουν την ασθένεια, δενν υπήρξε κάποια συγκέντρωση ενός από τους δύο παράγοντες που να υπερτερεί σταθερά από τις υπόλοιπες και στα 3 πειράματα παθογένειας για την αποτελεσματικότητα της. Τέλος, στα πειράματα παθογένειας σε φυτά Nicotiana tabacum για την αξιολόγηση των δύο παραγόντων κατά του TMV, ο παράγοντας Β στις συγκεντρώσεις 10 και 50 mM, παρουσιάζεται αποτελεσματικότερος στην αντιμετώπιση της ασθένειας. Επιπλέον, από τα πειράματα παθογένειας προέκυψαν χρήσιμα στοιχεία σε σχέση με την επίδραση της εφαρμογής των δύο επιφανειοδραστικών αυτών παραγόντων στα φυτά σε συνθήκες θερμοκηπίου. Οι παράγοντες Α και Β φάνηκε να προκαλούν νέκρωση στην φυλλική επιφάνεια του φυτού στο οποίο εφαρμόζονταν. Η νέκρωση επιδεινώθηκε όταν οι παράγοντες εφαρμόσθηκαν με ψεκασμό ακόμα και σε μικρότερες συγκεντρώσεις, σε ένα φύλλο ή και σε ολόκληρη τη φυλλική επιφάνεια τόσο των φυτών Arabidopsis thaliana, όσο και των φυτών Nicotiana tabacum, ενώ η παρουσία νεκρώσεων ακόμα και όταν δεν χρησιμοποιήθηκε προσκολλητικό Agral, δείχνει ότι οι νεκρώσεις είναι καθαρά επακόλουθο της εφαρμογής των παραγόντων αυτών. Με βάση τα αποτελέσματα συνίσταται η εφαρμογή των επιφανειοδραστικών παραγόντων με σταγόνες. Τέλος οι δύο παράγοντες αξιολογήθηκαν σε μοριακό επίπεδο, με τη μέθοδο της RT-PCR, για να εξεταστεί η δυνατότητα επαγωγής γονιδίων που διαδραματίζουν βασικό ρόλο στην άμυνα των φυτών όπως τα PR γονίδια (Pathogenesis-Related γονίδια ) στα φυτά. Ανιχνεύθηκε η παρουσία δύο PR γονιδίων των PR-1 και PR-5 που έχει αναγνωρισθεί από πολλές μελέτες ότι εμπλέκονται στις αμυντικές λειτουργίες του φυτού, σε cDNA που προήλθε από RNA που εξήχθη από φυτά Arabidopsis thaliana σε συγκεκριμένα χρονικά διαστήματα μετά από την εφαρμογή στα φυτά των παραγόντων Α και Β σε συγκέντρωση 10mM και Agral 0.02%. Η ηλεκτροφόρηση των αποτελεσμάτων της RT-PCR για τα PR1 και PR5 έδωσε ζώνες σε όλα τα χρονικά διαστήματα από την εφαρμογή των δύο παραγόντων και στην επέμβαση-μάρτυρα, με πολύ μικρές διαφορές ώστε να μην είναι ασφαλής η ανάλυση και η εξαγωγή πολύτιμων συμπερασμάτων. Τα αποτελέσματα από αυτή την εργασία μπορούν να αποτελέσουν χρήσιμο εργαλείο σε κάθε νέα προσπάθεια αξιολόγησης των δύο παραγόντων, η οποία δεν είναι ανάγκη να είναι τόσο γενικευμένη, αλλά θα έχει τη δυνατότητα να ερευνήσει περαιτέρω σε βάθος τη δράση τους.

Plants, during their evolution, acquired sophisticated defense mechanisms that confer resistance to a large amount of pathogens (fungi, bacteria and viruses) that come in contact on a daily basis. Systemic acquired resistance (SAR) in plants is a secondary defense response and is expressed as the biochemical stimulation of latent resistance responses, in a way that a plant prior susceptible to a host-pathogen interaction becomes resistant. The defense mechanisms of SAR, for a great variety of pathogens, are often so effective in the prevention and control of the disease that prompted scientists to try to reproduce the SAR phenomenon in the absence of pathogens by using various chemical compounds. In the current study, two cationic surfactants of ammonium bromide were evaluated for their ability to trigger the plant immune system. It is the first time that these surfactants are tested for their capacity to trigger systemic resistance in plants, whereas they play a major role as adjuvants when tested on other organisms (i.e. mammals). The two surfactants (A and B) were evaluated in three host-pathogen interaction systems: a) Arabidopsis thaliana infected with the oomycete Hyaloperonospora arabidopsis b) Arabidopsis thaliana infected with Verticillium dahliae and c) Nicotiana tabacum plants inoculated with TMV. Each of the factors A and B was applied at 3 different concentrations, in order to determine which one is more effective in the development of the disease symptoms or pathogen growth. The treatment with the factor A at concentration of 10 mM led to a reduction in sporulation of the oomycete Hyaloperonospora arabidopsis by 50% in experiments replicated three times. Pathogenicity tests with Verticillium dahliae showed that none of the concentrations of the two factors was found effective consistently in reducing the disease rate in three replications. Pathogenicity tests conducted in Nicotiana tabacum plants infected with TMV showed that factor B at concentrations of 10 and 50 mM, was more effective in the control of the virus. Further studies at molecular level performed in Arabidopsis thaliana, suggest that the factors A and B have the ability to trigger genes that play major role in the plant immunity, such as PR-1 and PR-5 genes (Pathogen Related Proteins) providing a first evidence for the mechanism of action of these compounds.