Εκκρινόμενες πρωτεϊνες βακτηρίων του γένους Azotobacter

Abstract

Historically, protein secretion has been more thoroughly investigated in Gram-negative bacteria. So far, six major protein secretion systems have been discovered and named as type I (T1SS), type II (T2SS), type III (T3SS), type IV (T4SS), type V (T5SS) and type VI (T6SS) respectively. The protein secretion systems characterized to date in Gram-positive bacteria include the Sec, Tat, FEA, FPE, holin and Wss pathways. Some of these systems, also exist in Gram-negative bacteria, such as Sec, where they mediate export of proteins into the periplasm.. Thus, although these systems permit protein secretion in Gram-positive bacteria, they cannot be considered as reliable secretion systems in Gram-negative bacteria. For both types of bacteria, once a secreted protein translocates across the outer membrane, then it can remain anchored to the membrane, associate covalently or non-covalently with cell-wall components in Gram-positive bacteria or with outer membrane components in Gram-negative bacteria, assemble into macromolecular structures on the cell surface (e.g. flagella and pili), be injected into a host cell, or be released in the extracellular area. In Gram-positive bacteria, secreted proteins are commonly translocated across the single membrane by the Sec pathway or the two-arginine (Tat) pathway. However, in some types of Gram-positive bacteria such as mycobacteria that have a hydrophobic, nearly impermeable cell wall, called mycomembrane, a specialized type VII secretion system translocates proteins across both the membrane and the cell wall. The machinery of the Sec pathway, recognizes on proteins destined for secretion, a hydrophobic N-terminal leader sequence and translocates them in an unfolded state, using ATP hydrolysis and a proton gradient for energy. The Tat pathway, transports folded proteins across membranes in archaea and bacteria. Translocation across the membrane is initiated by the interaction of the signal peptide with the Tat machinery. The amino-terminal (N-) region contains the Tat consensus motif (S/T)RRXFLK, which includes the signature twin arginine dipeptide. In this study we analyze the putative signal peptides of Azotobacter vinelandii. Using bioinformatic tools, we detect all the proteins of Azotobacter vinelandii AvOP, which seems to have a specific Tat motif and then analyze their sequences for putative signal peptide. In the end, we chose one and we analyzes it furthermore. 4 According to the SignalP results, Azotobacter vinelandii AvOP genome encodes 53 putative Tat signal peptide proteins. Those proteins, are almost double in number of those found in Escherichia coli, which are 29. Of those 53 proteins only 22 are in agreement with the other bioinformatics tools we used. In the end, we chose a protein, which according to bioinformatic tools is a putative Tat signal peptide protein and we analyzed it even more.

Ιστορικά, η πρωτεϊνική έκκριση έχει ερευνηθεί πιο διεξοδικά στα Gram-αρνητικά βακτήρια. Μέχρι τώρα, έχουν ανακαλυφθεί έξι μεγάλα πρωτεϊνικά εκκριτικά συστήματα και έχουν χαρακτηριστεί, ως εκκριτικό σύστημα τύπου I (T1SS), τύπου ΙΙ (Τ2SS), τύπου III (T3SS), τύπου IV (T4SS), τύπου V (T5SS) και τύπου VI (T6SS) αντίστοιχα. Τα πρωτεϊνικά εκκριτικά συστήματα, χαρακτηριζόμενα μέχρι σήμερα στα Gram-θετικά βακτήρια, περιλαμβάνουν τα μονοπάτια Sec, Tat, FEA, FPE holing και WSS. Μερικά από αυτά τα συστήματα. Υπάρχουν ήδη στα Gram-αρνητικά βακτήρια, όπως για παράδειγμα το Sec, τα οποία διευκολύνουν την εξαγωγή των πρωτεϊνών στο περιπλασματικό χώρο. Έτσι, παρόλο που αυτά τα συστήματα επιτρέπουν την έκκριση πρωτεϊνών στα Gram-θετικά βακτήρια, δεν μπορούν να θεωρηθούν αξιόπιστα εκκριτικά συστήματα στα Gram-αρνητικά βακτήρια. Και για τους δύο τύπους βακτηρίων, όταν μια εκκρινόμενη πρωτεΐνη μεταφερθεί κατά μήκος της εξωτερικής μεμβράνης, τότε αυτή, μπορεί να παραμείνει προσκολλημένη στη μεμβράνη, να συνδεθεί ομοιοπολικά ή μη με στοιχεία του κυτταρικού τοιχώματος στα Gram-θετικά βακτήρια ή με στοιχεί της εξωτερικής μεμβράνης στα Gram-αρνητικά βακτήρια, να δημιουργήσει μακρομοριακές δομές (μαστίγια και τριχίδια) στην κυτταρική επιφάνεια, να εισχωρήσει μέσα σε ένα κύτταρο ξενιστή, ή να απελευθερωθεί στον εξωκυτταρικό χώρο. Στα Gram-θετικά βακτήρια, οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες συνήθως μεταφέρονται κατά μήκος της μεμβράνης από το Sec μονοπάτι ή το μονοπάτι δύο-αργινινών (Tat). Όμως, σε ορισμένα είδη Gram-θετικών βακτηρίων, όπως στα μυκοβακρήρια, τα οποία έχουν ένα υδροφοβικό σχεδόν αδιαπέραστο κυτταρικό τοίχωμα, καλούμενο μυκομεμβράνη, ένα εξειδικευμένο εκκριτικό σύστημα τύπου VII, μεταφέρει τις πρωτεΐνες κατά μήκος και της μεμβράνης και του κυτταρικού τοιχώματος. Ο μηχανισμός του Sec μονοπατιού, αναγνωρίζει στις πρωτεΐνες που προορίζονται για έκκριση μια υδροφοβική Ν-τελική σηματοδοτική αλληλουχία και μεταφέρει τις πρωτεΐνες σε μια ανοικτή κατάσταση (μη διπλωμένη), χρησιμοποιώντας υδρόλυση του ATP και μια διαβάθμιση πρωτονίου για ενέργεια. Το μονοπάτι μεταφοράς Tat, έχει να κάνει με την μεταφορά πρωτεϊνών σε διπλωμένη κατάσταση, κατά μήκος των μεμβρανών στα αρχαία και βακτήρια. Η μεταφορά κατά μήκος των μεμβρανών, ξεκινάει από την αλληλεπίδραση του πεπτιδίου οδηγού με τον Tat μηχανισμό. Η άμινο-τελική (Ν-) περιοχή εμπεριέχει το Tat αποδεκτό μοτίβο (S/T)RRXFLK, το οποίο περιλαμβάνει το χαρακτηριστικό δύο αργινινών διπεπτίδιο. Στην παρούσα μελέτη αναλύθηκαν τα πιθανά Tat πεπτίδια οδηγούς του Azotobacter vinelandii. Πιο συγκεκριμένα, με την βοήθεια της βιοπληροφορικής, ανιχνεύθηκαν όλες οι πρωτεΐνες του Azotobacter vinelandii AvOP, οι οποίες παρουσιάζουν κάποιο από τα συγκεκριμένα Tat μοτίβα και στην συνέχεια αναλύθηκαν οι αλληλουχίες τους για την ύπαρξη πιθανόν πεπτιδίου οδηγού. Τέλος επιλέχθηκε μια από αυτές και πραγματοποιήθηκαν επιπλέον αναλύσεις, βιοπληροφορικά και πειραματικά. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα του SignalIP, το γωνιδίωμα του Azotobacter vinelandii AvOP, κωδικοποιεί 53 πρωτεΐνες που πιθανόν περιέχουν Tat πεπτίδιο οδηγό. Οι πρωτεΐνες αυτές είναι σχεδόν διπλάσιες στον αριθμό, από αυτές που ανιχνεύθηκαν στο Escherichia coli, στο οποίο βρέθηκαν 29 πρωτεΐνες που πιθανόν έχουν Tat πεπτίδιο οδηγό. Από τις 53 αυτές πρωτεΐνες, μόνο 22 συμφωνούν με τα στοιχεία των υπόλοιπων εργαλείων βιοπληροφορικής που χρησιμοποιήθηκαν. Τέλος, επιλέχθηκε μια πρωτεινη, η οποία σύμφωνα με τα αποτελέσματα των εργαλείων βιοπληροφορικής, πιθανόν να έχει Tat πεπτίδιο οδηγό και αναλύθηκε πιο διεξοδικά.