Μοριακός χαρακτηρισμός, παθογένεια και αντιμετώπιση του καμαροσπορίου της φιστικιάς

Abstract

Οι μύκητες του γένους Botryosphaeria. προσβάλλουν πολλά είδη φυτών, μεταξύ των οποίων σημαντική είναι η προσβολή στην φιστικιά. Τα είδη που έχουν βρεθεί στην φιστικιά παλαιότερα θεωρείτο ότι ανήκαν στο γένος Camarosporium. ωστόσο νέα ταξινόμηση τα εισάγει στα γένη Neofusicoccum ή Fusicoccum. Η τέλεια μορφή δεν έχει βρεθεί στην φιστικιά, ωστόσο με βάση τους χαρακτήρες της ατελούς μορφής το παθογόνο της φιστικιάς στην Καλιφόρνια των ΗΠΑ έχει ονομαστεί Botryosphaeria dothidea.

Σκοποί της παρούσας μελέτης ήταν ο μοριακός χαρακτηρισμός απομονώσεων καμαροσπορίου από διάφορους ξενιστές βάση των περιοχών ITS, η ανάλυση στελεχών βάση της παθογόνου δύναμης και η διερεύνηση της χρήσης των πιο κατάλληλων μυκητοκτόνων για τον έλεγχο της ασθένειας.

Για τον μοριακό χαρακτηρισμό χρησιμοποιήθηκαν 10 απομονώσεις από 5 ξενιστές: φιστικιά, ελιά, αμπέλι, δαμασκηνιά και σοφόρα. Η πειραματική προσέγγιση περιελάμβανε τον πολλαπλασιασμό αλληλουχιών με PCR, τον προσδιορισμό της αλληλουχίας των και τη στατιστική και φυλογενετική ανάλυσή τους. Οι αλληλουχίες που χρησιμοποιήθηκαν προέρχονται από τους πυρηνικούς γονιδιακούς τόπους ITS1, 5.8S και ITS2 οι οποίοι είναι από τους πιο διαδεδομένους δείκτες για μελέτες σε επίπεδο γενών και ειδών. Το τελικό σύνολο των στοιχισμένων αλληλουχιών, μετά την αφαίρεση τμημάτων από την αρχή και το τέλος τους, είχε μήκος 566 βάσεων.

Σε γενικές γραμμές οι 10 απομονώσεις διαχωρίζονται ανά ξενιστή, με την εξαίρεση των απομονώσεων από ελιά, σοφόρα και δαμασκηνιά που είναι σχεδόν όμοιες. Από την μοριακή ανάλυση των απομονώσεων, οι 5 από φιστικιά κατετάγησαν στο είδος Neofusicoccum vitifusiforme, ανεξαρτήτως γεωγραφικής προέλευσης (Αττική ή Φθιώτιδα). Στο είδος Botryosphaeria dothidea ταυτοποιήθηκαν 3 απομονώσεις: 1 από σοφόρα, 1 από ελιά και 1 από δαμασκηνιά. Οι 2 απομονώσεις από αμπέλι ανήκαν στο είδος Botryosphaeria obtusa. Στο φυλογενετικό δέντρο όλες οι απομονώσεις από φιστικιά ομαδοποιήθηκαν στον ίδιο κλάδο που διαχωριζόταν από τον κλάδο που συμπεριελάμβανε τις απομονώσεις του είδους Botryosphaeria dothidea (και από τους τρεις ξενιστές) με διαφοροποίηση 3%. Οι απομονώσεις από αμπέλι ομαδοποιήθηκαν σε διαφορετικό κλάδο και διέφεραν κατά 6% από τις απομονώσεις των άλλων δυο κλάδων.

Η ανάλυση στελεχών βάση της παθογόνου δύναμης πραγματοποιήθηκε με τεχνητές μολύνσεις σε αποκομμένα φύλλα φιστικιάς και σε κλαδίσκους φιστικιάς in planta. Για τα φύλλα υπολογίστηκε το σχετικό εμβαδό κάτω από την καμπύλη ασθένειας και για τους κλάδους το μήκος του μεταχρωματισμού στο ξύλο. Γενικά δεν βρεθήκαν σημαντικές διαφορές στην παθογένεια εκτός της απομόνωσης από αμπέλι που είχε σημαντικά μικρότερη παθογόνο δύναμη σε σχέση με τις υπόλοιπες απομονώσεις καθώς και διαφορές μεταξύ απομονώσεων από φιστικιά. Επίσης, και στις μολύνσεις φύλλων και κλαδίσκων οι απομονώσεις ελιάς και σοφόρας είχαν παρόμοια παθογόνο δύναμη.

Για την δοκιμή ευαισθησίας σε διάφορες δραστικές ουσίες χρησιμοποιήθηκαν 4 απομονώσεις που προερχόταν από πειραματικούς αγρούς στους οποίους είχε γίνει επέμβαση με τα μυκητοκτόνα Stroby (kresoxim methyl), Signum (pyraclostrobin και boscalid), Switch (cyprodinil και fludioxonil) και Quadris (azoxystrobin) συν μια από δέντρο που δεν είχε ψεκαστεί με μυκητοκτόνο. Πραγματοποιήθηκαν μετρήσεις ανάπτυξης μυκηλίου σε τρυβλία με υλικό PDA στο οποίο είχε ενσωματωθεί μυκηκτόνο. Τα μυκητοκτόνα που χρησιμοποιήθηκαν ήταν τα 4 ανωτέρω συν το Neotopsin fthiophanate methyl) που ψεκάζεται μια φορά την Άνοιξη. Για κάθε μυκητοκτόνο χρησιμοποιήθηκαν 11 διαδοχικές συγκεντρώσεις με λόγο 3:1 και η μέγιστη συγκέντρωση ήταν η συνιστώμενη για ψεκασμό. Από την ανάλυση δεν προέκυψαν ιδιαίτερες διαφορές στο EC50 μεταξύ των στελεχών εκτός της απομόνωσης που προήλθε από δέντρο που είχε ψεκαστεί με Quadris σε PDA που είχε ενσωματωθεί το ίδιο μυκητοκτόνο (Quadris). Σε αυτήν την περίπτωση, το EC50 του στελέχους αυτού ήταν περίπου 3ppm και δεκαπλάσιο από τις υπόλοιπες 4 απομονώσεις.

The fungi of the genus Botryosphaeria is a very important pathogen regarding pistachio, causing the “panicle and shoot blight”. The species that cause blights to pistachio plants were known as Camarosporium sp. but new classifications associate it with Neofusicoccum or Fusicoccum genera. The teleiomorph on pistachio has not been found yet, however based on the characters of the anamorph it is assumed to belong to the genus Botryosphaeria sp. The goals of this project were 1)the molecular characterization of Camarosporium isolates based on rDNA ITS regions, 2)the characterization of isolates based on their pathogenicity and 3)the determination of the performance of the most appropriate fungicides for the control of the disease. For the molecular characterization 10 isolates out of 5 hosts (pistachio, olive, grapevine, plum & sophora) were used. The regions of the rDNA repeat from the 3′ end of the 18s gene to the 5′ end of the 28s gene were amplified using ITS4 and ITS5 primers, and their individual sequences were determined via automatic sequencing. These sequences were later compared to each other in order to determine their phylogenetic relations. Based on the phylogenetic data, the 10 isolates are grouped by host, with the exception of the isolates from olive, sophora & plum which are almost identical. Five of the isolates, which are all from pistachio, belong to the species Neofusicoccum vitifusiforme, regardless of region (Attiki, Fthiotida). The isolates from olive, sophora & plum are all classified as Botryosphaeria dothidea and the isolates from grapevine as Botryosphaeria obtusa. Τhe subclades of species Neofusicoccum vitifusiforme & Botryosphaeria dothidea differ from each other 3% and form a clade that differs 6% from the clade of grapevine isolates. The characterization of isolates concerning their pathogenicity was accomplished with pistachio detached leaf assays and shoot inoculation with mycelial plug. Relative AUDPC was calculated for the detached leaves and there were no notable differences with the exception of the reduced pathogenicity of the grapevine isolate and minor differences between pistachio isolates. Concerning the shoots inoculations the differences were less significant but the grapevine isolate still had reduced pathogenicity. Likewise, the pathogenicity of the sophora and olive isolates was almost the same. As for the fungicide assay, isolates were obtained from pistachio orchards on which 4 different fungicide sprays were applied. These fungicides were Stroby (kresoxim methyl), Signum (pyraclostrobin and boscalid), Switch (cyprodinil and fludioxonil) and Quadris (azoxystrobin). The same fungicides plus Neotospin (thiophanate methyl) that was applied in all orchards before bloom were tested in vitro for their effect on mycelial growth inhibition. The total isolates used were 5, one from each orchard on which different fungicide was applied and one from an orchard where no fungicide was applied. For every fungicide a total of 11 threefold dilution concentrations were used with the highest, which is recommended for application in planta. From the assay there were no significant differences except from the fungicide Quadris where the isolate from trees sprayed with Quadris had EC50=3ppm azoxystrobin which was ten times greater than the rest of isolates.