Ανοσοεντοπισμός και ενεργότητα της πυροφωσφορυλάσης της ουριδινοδιφωσφορογλυκόζης (UGPάσης) σε αναπτυσσόμενους ανθοφόρους οφθαλμούς της τομάτας

Abstract

Η παρουσία του ενζύμου της πυροφωσφορυλάσης της ουριδινοδιφωσφορο- γλυκόζης (UGPάσης) μελετήθηκε σε αναπτυσσόμενους ανθοφόρους οφθαλμούς τομάτας (Solanum lycopersicum) οι οποίοι διαχωρίστηκαν σε τέσσερις κατηγορίες με βάση το μέγεθός τους. Η πρώτη κατηγορία περιελάμβανε ανθοφόρους οφθαλμούς μήκους 0-3 mm, η δεύτερη 3-8 mm, η τρίτη από 8 mm έως λίγο πριν από την άνθηση και η τέταρτη κατηγορία περιελάμβανε ώριμα άνθη. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν οι τεχνικές του in situ εντοπισμού και ανοσοεντοπισμού του ενζύμου. Παράλληλα, μελετήθηκε η ηλεκτροφορητική συμπεριφορά και προσδιορίστηκε η in vitro δραστικότητα της UGPάσης. Τα αποτελέσματα έδειξαν ότι η UGPάση εντοπίστηκε έντονα στην ωοθήκη, στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες και την εξωτερική επιδερμίδα των ανθήρων και στον τάπητα (στα δύο πρώτα αναπτυξιακά στάδια), ενώ μικρότερη ήταν η ένταση του σήματος στην επιδερμίδα των πετάλων και στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες των πετάλων και των σεπάλων. Από τις μετρήσεις της ενζυμικής δραστικότητας σε ολόκληρα άνθη, διαπιστώθηκε ότι το ένζυμο της UGPάσης ενεργοποιείται κυρίως κατά το αναπτυξιακό στάδιο της άνθησης με 129,1 nM NADH/min*μg πρωτεΐνης, ενώ η μικρότερη δραστικότητα εντοπίστηκε στο αναπτυξιακό στάδιο 3-8 mm με 47,4 nM NADH/min*μg πρωτεΐνης. Τα πειραματικά δεδομένα αποκάλυψαν ότι το πρότυπο εντοπισμού της in situ ενεργότητας του ενζύμου συνέπεσε με το πρότυπο ανοσοεντοπισμού της πρωτεΐνης, ενώ η μελέτη της ηλεκτροφορητικής συμπεριφοράς του ενζύμου κατέδειξε την ύπαρξη πολλών ηλεκτροφορητικών ζωνών οι οποίες πιθανόν να αντιστοιχούν σε ολιγομερή ή σε πολυμερή ή σε διαφορετικές διαμορφώσεις του ενζύμου. Τέλος, για πρώτη φορά ανιχνεύτηκε η τρανσφεράση της ακυλογλυκόζης, ένα ένζυμο που συμμετέχει στη βιοσύνθεση ακυλογλυκοζιδίων που επικαλύπτουν την επιδερμίδα.

The presence of the uridine diphosphate pyrophosphorylase (UGPase) enzyme was studied in tomato (Solanum lycopersicum) growing flower buds which were divided to four categories according to their size. The first category included flower bunds 0-3 mm in length, the second 3-8 mm, the third 8 mm to preanthesis and the fourth category included mature flowers. For this purpose, the techniques of in situ activity localization and immunolocalization of the enzyme were used. The electophoretic pattern was studied and the in vitro activity of UGPase was defined, as well. The results showed that UGPase was mainly localised in the ovary, in vascular bundle and overall epidermis of the anther and in the tapetum (in the first two stages of development), while signal tension was lower in petals epidermis and in petals and sepals of vascular bundles. Enzyme activity from flowers revealed that UGPase is active mainly during anthesis (129,1 nM NADH/min*μg protein), while the smallest activity was found at the developing stage 3-8 mm (47,4 nM NADH/min*μg protein). Experimental data revealed that the pattern of the in situ activity localization of the enzyme coincided with that of the protein localization, while the study of enzyme electophoretic pattern showed the existence of many bands which propably correspond to oligomers or polymers or different enzyme forms. Finally, the presence of acyl-glucose transferase, an enzyme responsible for acyl-glucose synthesis, was verified for the first time, in flower epidermis.