Μελέτη ρυθμιστικών στοιχείων ενός φωτοπεριοδκά ελεγχόμενου γονιδίου του φασολιού (Phaseolus vulgaris)

Abstract

Πολλές πτυχές της συμπεριφοράς και της φυσιολογίας, τόσο των φυτών όσο και των ζώων, εμφανίζουν μία 24ωρη ταλάντωση κατά τη διάρκεια κάθε μέρας. Κάποιες από αυτές τις ταλαντώσεις συμβαίνουν ως απόκριση σε περιβαλλοντικούς παράγοντες, όπως οι κύκλοι ημέρας/νύχτας, και διατηρούνται και κάτω από σταθερές συνθήκες. Οι ρυθμοί αυτοί ονομάζονται κιρκαδικοί (circadian) από το λατινικό circa dies, περίπου μία ημέρα. Οι κιρκαδικοί ρυθμοί στα φυτά συμπεριλαμβάνουν την κίνηση φύλλων και πετάλων, το άνοιγμα των στοματίων, καθημερινές ταλαντώσεις σε μεταβολικές δραστηριότητες όπως η αναπνοή και η φωτοσύνθεση και διέπονται από ένα ενδογενές σύστημα καταγραφής του χρόνου, το κιρκαδικό ρολόι, το οποίο χωρίζεται σε τρία δομικά συστατικά. Το πρώτο, τα μονοπάτια εισόδου στον κεντρικό ταλαντωτή, αφορά το πώς οι εξωτερικοί παράγοντες συντονίζουν το δεύτερο συστατικό, δηλαδή τον κεντρικό ταλαντωτή, με το περιβάλλον. Έτσι, δίνεται το έναυσμα στο τρίτο συστατικό του ρολογιού, τα μονοπάτια εξόδου από τον κεντρικό ταλαντωτή, τα οποία είναι οι εμφανείς ρυθμοί κάτω από τον έλεγχο του κιρκαδικού συστήματος. Ο κεντρικός ταλαντωτής συγκροτείται από αυτορυθμιζόμενους βρόγχους θετικής/αρνητικής επανατροφοδότησης (ανάδρασης) που αποτελούνται από συγκεκριμένους μεταγραφικούς παράγοντες. Κάποιοι από τους κύριους μεταγραφικούς παράγοντες που συνιστούν τον κεντρικό ταλαντωτή του πειραματόφυτου A. thaliana είναι οι CCA1 (Circadian Clock Associated 1) και LHY (Late elongated HYpocotyl) που αποτελούν τα αρνητικά στοιχεία του βρόγχου και ο APRR1/TOC1 (Arabidopsis Pseudo Response Regulator 1/Timing Of CAB expression 1) ή απλά παράγοντας TOC1, ο οποίος αποτελεί το θετικό παράγοντα του βρόγχου. Ο ορθόλογος παράγοντας του TOC1 από το φασόλι (PvTOC1, Phaseolus vulgaris Timing Of CAB expression 1) φαίνεται να αποκρίνεται σε φωτεινά ερεθίσματα κατά τη διάρκεια της νύχτας, κάτι το οποίο δεν έχει διαπιστωθεί για τον TOC1 του A. thaliana. Παρουσιάζει, λοιπόν, ενδιαφέρον η μελέτη των ρυθμιστικών στοιχείων της έκφρασης του γονιδίου PvTOC1, όπως ο υποκινητής του. Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν να κατασκευαστεί ένα σύστημα αναφοράς για τη μελέτη του υποψήφιου υποκινητή του φωτοπεριοδικά ελεγχόμενου γονιδίου του κιρκαδικού ρολογιού του φασολιού, PvTOC1. Για την πραγματοποίηση αυτού του σκοπού, απομονώθηκε, αρχικά, το 5΄-άκρο του cDNA του PvTOC1. Αυτό αποτέλεσε το πρώτο βήμα για την απομόνωση της 5΄-αμετάφραστης περιοχής του γονιδίου, δηλαδή μίας περιοχής του υποκινητή του PvTOC1 μήκους 1250 ζευγών βάσεων. Η αλλληλουχία που προέκυψε αναλύθηκε in silico και εντοπίστηκε σε αυτή σημαντικός αριθμός cis-ρυθμιστικών στοιχείων, τα οποία πιθανά να ευθύνονται για τη ρύθμιση της έκφρασης του γονιδίου υπό συγκεκριμένες συνθήκες. Τμήμα της αλληλουχίας του υποψήφιου υποκινητή κλωνοποιήθηκε σε φορέα έκφρασης (τροποποιημένος pBI221-Luc), έτσι ώστε να μπορεί να μελετηθεί η λειτουργία των ρυθμιστικών στοιχείων που εμπεριέχει. Τέλος, κατασκευάστηκε ένα σύστημα αναφοράς πρωτοπλαστών από φύλλα φασολιού, το οποίο μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τη λειτουργική μελέτη του τμήματος του PvTOC1 υποψήφιου υποκινητή που έχει κλωνοποιηθεί σε φορέα έκφρασης. Αυτή η μεθοδολογία μπορεί να εφαρμοστεί και για τη μελέτη και άλλων τμημάτων του υποκινητή του PvTOC1, αλλά και ρυθμιστικών στοιχείων άλλων γονιδίων του ρολογιού του φυτού.

Many aspects of the behavior and physiology of plants and animals fluctuate over the course of each day. Some of these fluctuations occur in response to environmental factors, such as light/dark circles and persist under constant conditions. These rhythms are designated as circadian, from the Latin circa dies, which means almost a day. Circadian rhythms in plants include the daily movement of leaves and petals, stomata opening, diurnal oscillations in metabolic functions such as respiration and photosynthesis. They are governed by an endogenous time keeper, the circadian clock, which is divided into three components. The first, the input pathway, is how external cues entrain the second component, the central oscillator, to the environment. This triggers the third component, the output pathways, which are the overt rhythms under the control of the circadian system. The central oscillator is composed of autoregulatory positive/negative feedback loops based on the activity of specific transcription factors. The main transcription factors that constitute the central oscillator of the plant A. thaliana are CCA1 (Circadian Clock Associated 1) and LHY (Late elongated HYpocotyl) which belong to the negative elements of the loop and APRR1/TOC1 (Arabidopsis Pseudo Response Regulator 1/Timing Of CAB expression 1), or simply TOC1 factor, which is the positive element of the loop. The ortholog factor of TOC1 from bean (PvTOC1, Phaseolus vulgaris Timing Of CAB expression 1) appears to respond to light stimuli during the night period (scotophasis), which has not been shown before for A. thaliana TOC1. Therefore, it is important to study the regulatory elements of PvTOC1 gene expression in order to explore the underlying mechanism . The aim of the present study was the construction of a reporter system to analyze any putative promoter motifs of the photoperiodically controlled gene of bean, PvTOC1. For this purpose, initially, the 5΄-end of PvTOC1 cDNA was cloned. This was followed by the isolation of the 5΄- Untranslated Region (5΄-UTR) of the gene, corresponding to a part of the PvTOC1 promoter of 1250 bp length. The obtained sequence was analyzed in silico and several cis-regulatory elements were detected, which might account for the regulation of PvTOC1 gene expression under various regimes. Part of the sequence of the postulant promoter was cloned into an expression vector (modified pBI221-Luc), in order to study any putative regulatory elements. Finally, a reporter system was constructed from bean leaf protoplasts, which will be used for the functional analysis of the cloned PvTOC1 promoter. This methodology can be applied to future studies to analyze different parts of the PvTOC1 promoter, as well as of regulatory elements of other clock genes of the bean plant.