Διερεύνηση του ρόλου του αιθυλενίου στη παθογένεια του μύκητα Verticillium dahliae σε φυτά τομάτας μέσω της μελέτης του γονιδίου της ACC συνθάσης

Abstract

Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας διερευνήθηκε ο ρόλος του αιθυλενίου στην παθογένεια του μύκητα V. dahliae σε φυτά τομάτας, μέσω του γονιδίου της ACC συνθάσης, καθώς το ACC αποτελεί ένα πρόδρομο μόριο στο μεταβολικό μονοπάτι βιοσύνθεσης του αιθυλενίου.

Αρχικά πραγματοποιήθηκαν πειράματα ελέγχου απενεργοποίησης και επανενσωμάτωσης του γονιδίου ACC συνθάσης (ACS) σε μια σειρά μεταλλαγμένων στελεχών του μύκητα Verticillium dahliae στο γονίδιο ACS (χορηγία της Dr. Katherine Dobinson, Department of Agriculture and Agri-Food Canada, Department of Biology, The Univercity Of Western Ontario, Canada) και πειράματα ελέγχου των επιπέδων έκφρασης του γονιδίου ACS με Real-Time PCR.

Στη συνέχεια πραγματοποιήθηκαν πειράματα παθογένειας αλλά και ιστοπαθολογικής παρατήρησης της διαδικασίας μόλυνσης, με επιλεγμένα μεταλλαγμένα στελέχη στο γονίδιο ACS καθώς και το άγριο στέλεχος του μύκητα V. dahliae σε φυτά τομάτας. Διαπιστώθηκε ότι το AACS18.7 στέλεχος με απενεργοποιημένο το γονίδιο της ACS παρουσίασε στατιστικά λιγότερο έντονα συμπτώματα και χαμηλότερο ποσοστό ασθένειας σε σχέση με το άγριο στέλεχος. Για να διερευνηθεί αν η μείωση αυτή οφείλεται σε μειωμένη ανάπτυξη των παθογόνων στους αγγειακούς ιστούς των φυτών, πραγματοποιήθηκαν πειράματα ποσοτικοποίησης των μυκήτων με αντιδράσεις Real-time PCR σε διάφορες χρονικές στιγμές μετά την μόλυνση τους σε φυτά τομάτας. Τα πειράματα αυτά έδειξαν ότι η ποσότητα του μεταλλαγμένου στελέχους Δ ACS 18.7 ήταν σημαντικά μικρότερη από το άγριο στέλεχος υποδεικνύοντας την εμπλοκή του γονιδίου της ACS στην παθογένεια του μύκητα V. dahliae. Στα πειράματα ιστοπαθολογικής παρατήρησης της διαδικασίας μόλυνσης του άγριου στελέχους και του μεταλλαγμένου στελέχους AACS 18.7 σε φυτά τομάτας Ailsa Craig φάνηκε ότι δεν υπάρχει διαφορά ανάμεσα στο άγριο και στο AACS 18.7 μεταλλαγμένο στέλεχος ως προς την πρόσφυση και αποίκιση του ριζικού συστήματος στις 24 h μετά την εφαρμογή τους, ενώ στις 5 ημέρες μετά την μόλυνση οι υφές του άγριου στελέχους έχουν αποικήσει σε μεγαλύτερο βαθμό το ριζικό σύστημα των φυτών σε σχέση με το AACS 18.7.

Εν κατακλείδι η εργασία αυτή παρουσίασε το σημαντικό ρόλο του γονιδίου της ACC συνθάσης στην παθογένεια του μύκητα V. dahliae και την εμπλοκή του αιθυλενίου στην εκδήλωση συμπτωμάτων και την πρόκληση ασθένειας από το μύκητα V. dahliae.

Several studies have shown that some plant pathogenic fungi are able to produce ethylene. Three biosynthesis pathways leading to ethylene production are known in fungi, suggesting an important role of this compound among those microorganisms, of which the one is characterized in higher plants and the other two pathways are found only in microorganisms. In the methionine dependent ethylene biosynthesis, methionine is first converted to the S-adenosyl methionine (S-AdoMet or SAM) intermediate by the SAM synthase, then SAM is converted to 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC) by the ACC synthase, and finally ethylene is produced from ACC by the ACC oxidase. This pathway, so called the ACC pathway, has been scarcely described in fungi. The second pathway has been first characterized in bacteria and is found too in several ethylene producing fungi. L-methionine is deaminated to α-keto-γ-methylthiobutyric acid (KMBA), which gives its name to this pathway and is further oxidized to ethylene. The third pathway which is a 2-oxoglutarate pathway is catalyzed by a single multifunction ethylene forming enzyme (EFE) in presence of other amino-acids as cofactors, such as arginine or lysine, depending on the fungus studied. This enzyme is an ascorbate oxidase catalyzing two reactions simultaneously. The primary reaction leads to ethylene production by oxygenation of the 2-oxoglutarate, while in a secondary reaction EFE catalyzes the production of succinate, guanidine, and pyrroline carboxylate. The soil-borne fungi Verticillium dahliae is able to produce ethylene; however, it remains unclear whether the fungal ethylene produced in planta is required for the development of the pathogen or it acts as a virulence factor. In order to investigate the role of ethylene in Verticillium dahliae pathogenicity, an ACS gene (encoding a key enzyme involved in ethylene biosynthesis) was inactivated in a Verticillium isolate through transposon mutagenesis. The inactivation of ACS was verified by Real-time PCR gene expression analysis. Pathogenicity experiments showed that the ΔACS18.7 mutant caused typical symptoms in tomato plants; however, there was a statistically significant reduction in disease severity compared to that of the wild type strain. Complementation of ACS in ΔACS mutant restored the disease severity caused by the pathogen. Quantitative Real-time PCR analysis revealed that the decrease in symptom severity shown in tomato plants inoculated with ΔACS18.7 mutants was associated with significant reductions in the growth of the pathogen in the vascular tissues of the plants. Microscopic observation of the infection behavior of a red fluorescent protein (Ds-Red) - labeled ΔACS 18.7 mutant and a wild type strain showed that after 24 hours both wild type and mutant spores had attached at the root surface. However 5 days after inoculation the ΔACS 18.7 mutant showed less hyphal growth and colonized xylem vessels considerably less than the wild type strain. The results of the present study suggest a role of ACS in virulence and vascular colonization of the soilborne fungus V. dahliae.