Ο μύκητας Verticillium dahliae προσβάλλει πολλά αυτοφυή και καλλιεργούμενα φυτά μεταξύ των οποίων είναι η τομάτα και το βαμβάκι. Επίσης, παράγει μικρού και μεγάλου μοριακού βάρους τοξικούς μεταβολίτες των φυτών που λειτουργούν ως υποκινητές της φυτικής άμυνας χωρίς ωστόσο να έχουν απομονωθεί συγκεκριμένες χημικές ουσίες με συγκεκριμένο μηχανισμό δράσης.
Σχετικά πρόσφατα, έχουν απομονωθεί πρωτεΐνες από ωομύκητες, μύκητες και βακτήρια που λειτουργούν ως επαγωγείς της άμυνας των φυτών και οι οποίες έχουν καταταγεί στην οικογένεια των NLP (Nep1 like proteins). Ο ρόλος των NLP πρωτεϊνών στην παθογένεια των οργανισμών που τις παράγουν δεν είναι ξεκάθαρος. Όταν οι πρωτεΐνες αυτές εκφραστούν in planta είναι πιθανό, να ενεργοποιούν τους μηχανισμούς άμυνας των ξενιστών τους καθοδηγώντας τον περιορισμό της εξάπλωσης του παθογόνου και κατά συνέπεια τον περιορισμό της εξέλιξης της ασθένειας. Επιπλέον, τα παθογόνα μπορούν να κατευθύνουν την εκδήλωση της αντίδρασης υπερευαισθησίας (μορφή προγραμματισμένου κυτταρικού θανάτου) προς όφελος τους, ώστε να αντλήσουν απαραίτητα για αυτά θρεπτικά στοιχεία ή και να προφυλαχθούν από τους αμυντικούς μηχανισμούς του φυτού.
Η NLP πρωτεΐνη 233 αμινοξέων, του μύκητα V. dahliae ονομάστηκε VdNEP (Verticillium dahliae Necrosis and ethylene inducing peptide, VdNep). Η VdNep είναι ισχυρός ενεργοποιητής της άμυνας σε φυτά Nicotiana benthamiana, Arabidopsis thaliana και βαμβάκι και επάγει τον σχηματισμό συμπτωμάτων νέκρωσης και μάρανσης σε κοτυληδόνες και φύλλα βαμβακιού. Όταν απομονώθηκε και εφαρμόστηκε σε φυτά N. benthamiana και A. thaliana επήγαγε το σχηματισμό ενεργών μορφών οξυγόνου και πρωτεϊνών παθογένειας που εμπλέκονται στα μονοπάτια φυτικής άμυνας του σαλικυλικού οξέος και ιασμονικού οξέος. Τέλος, η εφαρμογή της VdNEP, ως πρωτεΐνη σύντηξης με κατάλοιπα ιστιδίνης (His-VdNEP), σε φυτά A. thaliana οδήγησε σε αύξηση της παραγωγής αιθυλενίου στα φυτά αυτά (Wang et al., 2004).
Η μελέτη της λειτουργίας της VdNEP πραγματοποιήθηκε με την in planta υπερέκφραση της, μετά την κλωνοποίηση της σε κατάλληλο ιικό φορέα. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε ένας Τi φορέας που κωδικοποιούσε το cDNA του ιού TRV, στο T-DNA του, υπό τον έλεγχο κατάλληλου υποκινητή και τερματιστή που να είναι λειτουργικοί στα φυτικά κύτταρα. Όταν το Τ-DNA ενσωματωθεί στα κύτταρα του φυτού, ο ιός μεταγράφεται και έχει τη δυνατότητα πλέον να μετακινείται διασυστηματικά στους ιστούς του φυτού. Η μετακίνηση του ιού διασπείρει και τη VdNEP η οποία εκφράζεται διασυστηματικά στους ιστούς του φυτού. Επίσης, χρησιμοποιήθηκε ως θετικός μάρτυρας και ένας TRV φορέας που κωδικοποιούσε
τμήμα του γονιδίου της δεσατουράσης του φυτοενίου που δίνει τον φαινότυπο της φωτολεύκανσης στα φυτά στα οποία θα εκφραστεί.
Τα φυτά τομάτας που είχαν εμβολιαστεί με το φορέα pTRV-VdNEP, σε διάστημα τριών περίπου εβδομάδων εμφάνισαν διασυστηματικά συμπτώματα αδρομύκωσης όπως μαράνσεις, χλωρώσεις, νεκρώσεις που ομοίαζαν με αυτά που δίνει ο μύκητας V. dahliae. Τα φυτά που είχαν εμβολιαστεί με το φορέα pTRV-PDS σε λιγότερο από τρεις εβδομάδες έδωσαν τον τυπικό φαινότυπο της φωτολεύκανσης.
Επίσης, πραγματοποιήθηκε αξιολόγηση της παθογένειας τεσσάρων στελεχών από τρεις φυλές του μύκητα V dahliae που υπερέκφραζαν την πρωτεΐνη VdNEP, επί τριών ξενιστών του μύκητα V. dahliae, δηλαδή της τομάτας, του βαμβακιού και του A. thaliana.
Από τα αποτελέσματα προέκυψε πως η υπερέκφραση της πρωτεΐνης VdNEP σε στελέχη της αποφυλλωτικής φυλής του βαμβακιού (22V), της μη αποφυλλωτικής του βαμβακιού (25V) και τη φυλή 1 της τομάτας οδήγησε σε αύξηση του σχετικού AUDPC, σε σχέση με τις αντίστοιχες άγριες φυλές του μύκητα, στα φυτά που μολύνθηκαν ενώ διεύρυνε και τον κύκλο των ξενιστών της φυλής 1 της τομάτας. Επίσης, τα συμπτώματα που παρατηρήθηκαν στην τομάτα και το βαμβάκι είχαν την αλληλουχία των συμπτωμάτων του συνδρόμου των αδρομυκώσεων. Πιο συγκεκριμένα, το στέλεχος της αποφυλλωτικής φυλής που υπερέκφραζε το VdNEP δε μόλυνε την τομάτα ενώ στο βαμβάκι και το A. thaliana έδωσε υψηλά ποσοστά ασθένειας. Τα δύο στελέχη της μη αποφυλλωτικής φυλής που υπερέκφραζαν το VdNEP έδωσαν τα χαμηλότερα ποσοστά ασθένειας στα τρία φυτά, ενώ η εμφάνιση των συμπτωμάτων εμφάνισε μια χρονική υστέρηση σε σχέση με τα άλλα υπερεκφράζοντα στελέχη του μύκητα. Το στέλεχος της φυλής 1 της τομάτας που υπερέκφραζε το VdNEP εμφάνισε τα υψηλότερα ποσοστά ασθένειας στη τομάτα ενώ μόλυνε εξίσου ισχυρά και το βαμβάκι. Τέλος, παρατηρήθηκε σημαντική διαφοροποίηση στο ύψος των φυτών τομάτας που μολύνθηκαν με το υπερεκφράζον στέλεχος της φυλής 1 της τομάτας και το αντίστοιχο άγριο.
Φαίνεται λοιπόν από τα παραπάνω, πως η πρωτεΐνη VdNEP εμπλέκεται στην παθογένεια του μύκητα V. dahliae.
V. dahliae causes wilt in a wide range of plants, including tomato and cotton. It is reported to produce molecules that induce host cell death. Until now crude extracts that contain Verticillium toxin complexes have been used to elicit plant defence responses or to study physiological responses of the plants. However, the exact nature of the components of the complexes is often unclear.
Recently, in several different fungi, oomycetes and bacteria, proteins have been identified that appear to belong to a newly recognized family of elicitor molecules called NLPs (Nep1-like proteins, necrosis and ethylene inducing proteins).
Τhe role of the NLPs in plant pathogenicity, if any, remains uncertain. If expressed in planta, these proteins could alert plants to the presence of invading microbes by triggering plant defences, potentially bringing any infection to an untimely end.
On the other hand, the induction of a hypersensitivity response could be used to the advantage of the pathogen so as to to release nutrients for the invading microbe population. It has also been proposed that dead plant cells act as a protective barrier for invading microbes against plant defences.
This protein, named V. dahliae necrosis- and ethylene-inducing protein (VdNEP), is composed of 233 amino acids and has a high activity in triggering plant defense responses in Nicotiana benthamiana, Arabidopsis thaliana, and cotton. It also induces wilting of cotton leaves and cotyledons. In A. thaliana and N. benthamiana, VdNEP also triggered production of reactive oxygen species and induced the expression of PR genes. Finally, when VdNEP (as a HIS-Tag fusion protein) was infiltrated into leaves of A. thaliana it induced ethylene biosynthesis (Wang et al., 2004).
Here, we demonstrate the in planta overexpression of VdNEP protein in tomato plants by using the agroinoculation technique. For this we used a disarmed TRV vector which was modified with VdNEP sequence and was introduced in Agrobacterium tumefaciens engineered T-DNA plasmids. The Agrobacterium cells carrying the insert can be inoculated directly into the plant. The plant cells at the site of inoculation are transformed with the virus vector. These cells would then serve as a reservoir of infection, which spreads systemically throughout the plant. We also used as a positive marker of VdNEP expression, the TRV vector, carrying tomato phytoene desaturase (PDS) gene fragment, in order to suppress the expression of the endogenous PDS gene in tomato plants. A 1:1 mixture of Agrobacterium cultures containing pTRV2, pTRV2-PDS, pTRV2-VdNEP and pTRV1, was infiltrated onto the cotyledons of tomato plants. Tomato plants infected with pTRV-VdNEP developed in about three weeks systemic wilting chlorosis and necrosis symptoms, which were alike those observed in the Verticillium wilt syndrome. Tomato plants infected with pTRV-PDS vector expressed the photo-bleached phenotype in the upper leaves, sooner than 3 weeks post Agro-infiltration and remained white for at least 1 month.
We also examined the phytopathogenicity of three pathotypes of V. dahliae that overexpressed VdNEP in cotton, tomato and A. thaliana plants.
Four isolates, one of the defoliating V. dahliae pathotype (22V6NEP16), two of the non-defoliating V. dahliae pathotype (25V6NEP74, 25V6NEP77) and one of the tomato race 1 pathotype (70V6NEP1) were examined for their ability to increase disease severity in Verticillium hosts and broaden their host cycle. Here, we report, that all four isolates of the three pathotypes of V. dahliae that overexpressed the VdNEP protein increased the relative AUDPC in the inoculated three hosts and broadened the host range of the race 1 of tomato pathotype. Symptoms in tomato and cotton were similar with those observed in the Verticillium wilt syndrome. The defoliating V. dahliae pathotype that overexpressed VdNEP was not virulent in tomato whilst in cotton and A. thaliana produced severe symptoms. The two isolates that overexpressed VdNEP of the non-defoliating pathotype of V. dahliae produced lower disease severity percentages than those of the defoliating and the race 1 pathotypes that also overexpressed VdNEP protein. We also recorded a delay in expression of increased severity in the symptomatology of the the non-defoliating pathotype of V. dahliae that overexpressed VdNEP compared with the wild type isolate. The higher disease severity percentages were observed in tomato plants inoculated with Verticillium race 1 pathotype that overexpressed the VdNEP protein. They were of similar significance with those of the defoliating Verticillium pathotype. Finally, there was significant difference in tomato plant height between the overexpressing isolate of race 1 pathotype of tomato and the wild one of this pathotype.
From all these we conclude that the VdNEP protein seems to be severely implicated in V. dahliae pathogenicity in its hosts.
