Διερεύνηση της παρουσίας του ιού του συνδρόμου του αναπαραγωγικού και αναπνευστικού συστήματος του χοίρου με μοριακές τεχνικές σε εκτροφή με συμβατή κλινική εικόνα

Abstract

Το Σύνδρομο του Αναπαραγωγικού και Αναπνευστικού Συστήματος του Χοίρου, ΣΑΑΣΧ (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS) είναι ένα ιογενές νόσημα με παγκόσμια εξάπλωση. Σήμερα, 20 χρόνια μετά την απομόνωση του υπεύθυνου ιού, αποτελεί ένα από τα σημαντικότερα νοσήματα προκαλώντας τεράστιες οικονομικές απώλειες στην παγκόσμια χοιροτροφία. Χαρακτηρίζεται από διαταραχές στον αναπαραγωγικό πληθυσμό και αναπνευστικά προβλήματα στους αναπτυσσόμενους και παχυνόμενους χοίρους. Η σοβαρότητα της λοίμωξης από τον ιό ποικίλλει, από παντελή έλλειψη κλινικών συμπτωμάτων έως απότομα ξεσπάσματα προβλημάτων στην αναπαραγωγή και στο αναπνευστικό σύστημα. Αποτέλεσμα της έντονης γενετικής ποικιλομορφίας που χαρακτηρίζει τον εν λόγω ιό, ήταν η εμφάνιση δύο ξεχωριστών τύπων, του τύπου Ι ή ευρωπαϊκού γονότυπου και του τύπου ΙΙ ή αμερικάνικου γονότυπου του ιού. Σκοπός της παρούσας μελέτης ήταν η διερεύνηση της παρουσίας του ιού του ΣΑΑΣΧ με μοριακές τεχνικές σε εκτροφή με συμβατή κλινική εικόνα και ο μοριακός χαρακτηρισμός του. Για τον σκοπό αυτό διενεργήθηκε δειγματοληψία σιέλου από σύες και οργάνων και ορών από αποβληθέντα και θνησιγενή χοιρίδια, από τον Ιανουάριο έως τον Νοέμβριο του 2010. Η εξέταση των δειγμάτων έγινε με χρήση των μεθόδων RT-PCR σε ένα βήμα, δύο βήματα και real time (RT-) PCR, με στόχο την ανίχνευση και τον χαρακτηρισμό του ιού. Με χρήση RT-PCR σε δύο βήματα, βρέθηκαν θετικά τα 55 από τα 95 δείγματα οργάνων και ορών των χοιριδίων (57,8%) και με την real time (RT-) PCR τα 57 από τα 95 (60%). Τα δείγματα σιέλου από τις σύες δεν ήταν θετικά σε καμία από τις δύο τεχνικές, ενώ κανένα δείγμα από σύες και χοιρίδια δεν βρέθηκε θετικό με την RT-PCR σε ένα βήμα. Τα προς αλληλούχηση δείγματα ενίσχυσαν μικτό πληθυσμό και γι’ αυτό έλαβε χώρα κλωνοποίηση των δειγμάτων με τους εκκινητές της RT-PCR δύο βημάτων. Μετά τον προσδιορισμό της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας της μίας αποικίας που είχε ενσωματώσει το ένθεμα (προϊόν PCR), αυτή χαρακτηρίστηκε ως ανθρώπινο DNA. Παράλληλα, με τα δείγματα των ζώων έγινε και εξέταση δειγμάτων ανθρώπινου αίματος με τη real-time PCR και διαπιστώθηκε ότι εκτός από το τμήμα του ιικού RNA, ενισχύεται και τμήμα ανθρώπινου DNA. Από την παρούσα έρευνα, είναι γεγονός ότι οι εκκινητές που χρησιμοποιήθηκαν στις μοριακές τεχνικές, πολλαπλασιάζουν ανθρώπινο DNA. Όμως, δίνουν και ένα ακόμη προϊόν PCR, παρόμοιου μεγέθους, που είναι σχεδόν αδύνατο να διαφοροποιηθεί οπτικά. Το δεύτερο αυτό προϊόν της PCR πιθανόν να προέρχεται από την ενίσχυση τμήματος του γονιδιώματος του ιού του ΣΑΑΣΧ, που με την RT- PCR έχει μέγεθος 637 ζεύγη βάσεων νουκλεοτιδίων, ενώ με την real time (RT-) PCR, 116 ζεύγη βάσεων. Συνοψίζοντας, διαπιστώθηκε ότι δημοσιευμένα και ευρέως χρησιμοποιούμενα πρωτόκολλα, είναι δυνατό να οδηγήσουν σε διαγνωστικά λάθη, μέσω ψευδώς θετικών αποτελεσμάτων, δίνοντας τη δυνατότητα περαιτέρω έρευνας σχετικά με την εφαρμογή μοριακών τεχνικών για την ανίχνευση του ιού του ΣΑΑΣΧ.

Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS, is a viral disease with global distribution. Today, 20 years after the detection of the responsible virus, this viral disease is one of the major diseases causing enormous economic losses in the global pig industry. This disease is mainly characterized by disturbances in the breeding population and respiratory problems in the growing and fattening pigs. The severity of infection varies from complete absence of clinical symptoms to sudden outbreaks of reproductive and respiratory problems. Due to the genetic variability, PRRS virus (PRRSV) is classified in two distinct types, Type I or European Type and Type II or American Type. The purpose of the present study was to identify the PRRSV with molecular techniques in a lifestock with clinical symptoms and to characterize the circulating strains. Sample’s collection took place between January of 2010 and November of 2010, for saliva from sows and organs and sera from aborted and stillborn piglets. One step RT-PCR, two steps RT-PCR and real time (RT-) PCR were used for PRRSV detection and characterization. From 95 samples of organs and serum of piglets, 55 were found positive (57.8%) using a 2 step RT-PCR and 57 (60.0%) using real time (RT-) PCR. Saliva samples from sows were negative by both techniques, while none of the samples from sows and pigs were positive using one step RT-PCR. A mixed population was detected by a genetic analyzer (sequencing) in the samples and a cloning step was introduced for these samples by using the primers of the two step RT-PCR. After sequencing of the single colony that had incorporated the insert (PCR product), the sequence found was characterized as human DNA. In addition, samples of human blood were also examined with real-time PCR and found that human DNA can be amplified. In the present study we have shown that the PCR primers amplify human DNA and another product of similar size that is difficult to discriminate between them visually. The second PCR product might have been derived from the virus genome and has a size of 637 bp by RT-RCR and 116 bp by real-time (RT-) PCR, respectively. Finally, we found that published and widely used protocols sometimes could lead to diagnostic errors and this study offers the opportunity to a further investigation and more accurate detection of PRRS virus by molecular techniques.