Μελέτη υδροαλκοολικών εκχυλισμάτων ριζών του φυτού Echinacea purpurea καλλιεργούμενου στην Ελλάδα

Abstract

H Echinacea purpurea είναι ένα φαρμακευτικό φυτό, το οποίο μόλις πρόσφατα άρχισε να καλλιεργείται στην Ελλάδα. Προκειμένου να παραληφθούν τα υδροαλκοολικά εκχυλίσματα από τις ρίζες της E. purpurea 0,5g αλεσμένης λεπτόκοκκης σκόνης ριζών εκχυλίστηκαν με 10mL διαλύματος CH O σε διάφορες αναλογίες υπό ανάδευση σε θερμοκρασία δωματίου για 15min, με ή χωρίς τη χρήση υπερήχων. Η πορεία εκχύλισης των φαινολικών συστατικών παρατηρούνταν με μέτρηση της απορρόφησης των εκχυλισμάτων στα 330nm. Η κινητική της εκχύλισης μελετήθηκε και για τις δύο μεθόδους χρησιμοποιώντας το σύστημα 70:30 το οποίο είχε δώσει μέγιστη απόδοση. Διαπιστώθηκε ότι χρειάζονται τέσσερις εκχυλίσεις ως αναγκαία συνθήκη για την παραλαβή ποσού πάνω από το 95% του ολικού φαινολικού περιεχομένου των ριζών του φυτού. Ακολούθησε ποιοτικός και ποσοτικός προσδιορισμός των φαινολικών συστατικών των εκχυλισμάτων καθώς και δύο εμπορικών σκευασμάτων Echinacea με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης-ανεστραμμένης φάσης (HPLC-RP) και υγρής χρωματογραφίας συνδυασμένης με φασματομετρία μαζών (LC/MS). Καφεϊκό, καφταρικό και κιχορικό οξύ χρησιμοποιήθηκαν ως πρότυπα. Ανεξάρτητα από τη μέθοδο της εκχύλισης καφταρικό και κιχορικό οξύ ταυτοποιήθηκαν και προσδιορίστηκαν ποσοτικά σε συγκεντρώσεις από 16,66-18,00 mg/g ξηρής ρίζας, ποσό το οποίο δεν ελαττώθηκε σημαντικά όταν τα εκχυλίσματα αποθηκεύθηκαν για μικρό χρονικό διάστημα (15d) στους -20°C. Τα αποτελέσματα από την ανάλυση στο LC-MS υποδεικνύουν την ύπαρξη χλωρογενικού οξέος, και κυναρίνης. Στα εμπορικά διαθέσιμα σκευάσματα μετρήθηκε καφταρικό και κιχορικό οξύ από 8,09 έως 9,03mg/g ξηρού φυτικού υλικού, το οποίο ήταν χαμηλότερο από το ποσό το οποίο μετρήθηκε στα υδροαλκοολικά εκχυλίσματα. Εχινακοζίτης και κυναρίνη ανιχνεύτηκαν και στα δύο εμπορικά σκευάσματα με ανάλυση LC-MS, ενώ χλωρογενικό οξύ βρέθηκε μόνο στο ένα από αυτά. Επιπλέον, το ολικό φαινολικό περιεχόμενο όλων των δειγμάτων προσδιορίστηκε με τη μέθοδο Folin-Ciocalteu. Η αντιοξειδωτική ικανότητα) προσδιορίστηκε με τη μέθοδο DPPH. Όλα τα αποτελέσματα εκφράστηκαν σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος Τα αποτελέσματα από τη μέθοδο Folin έδειξαν ότι η κλασσική μέθοδος είναι ισοδύναμη με τη μέθοδο την υποβοηθούμενη από υπερήχους (29,05±2,18mg/g ξηρής ρίζας). Τα εμπορικά σκευάσματα είχαν φαινολικά συστατικά σε χαμηλότερες συγκεντρώσεις (8,66±0,28mg/g). Για τον προσδιορισμό της αντιοξειδωτικής ικανότητας υπολογίστηκαν τα EC των εκχυλισμάτων και συγκρίθηκαν με εκείνα γνωστών αντιοξειδωτικών. Οι τιμές τους κυμαίνονταν από 2,87 έως 4,2ppm εκφρασμένα σε ισοδύναμα γαλλικού οξέος και δείχνουν σημαντική αντιοξειδωτική ικανότητα. Από τα δεδομένα προκύπτει ότι καλύτερη αντιοξειδωτική ικανότητα και μεγαλύτερη περιεκτικότητα σε φαινολικά συστατικά είχε το εκχύλισμα από την κλασσική μέθοδο. 50 Ακόμα, καταγράφηκε το φάσμα FT-IR των μη επεξεργασμένων ριζών σε σκόνη με την τεχνική διάχυτης ανάκλασης (DRIFT) καθώς και εκείνα και των υγρών εκχυλισμάτων με την τεχνική της εξασθενημένης ολικής ανάκλασης (ATR). Φαίνεται ότι υπάρχει άμεσος συσχετισμός της πορείας της εκχύλισης των φαινολικών συστατικών με το φάσμα FT-IR και ειδικότερα με την κορυφή στα 1510-1520cm , οπότε και θα μπορεί να δημιουργηθεί μια μέθοδος ακόμη και ποσοτικού προσδιορισμού των ολικών φαινολικών με μέτρηση του εμβαδού της κορυφής στα 1510-1520cm -1 . Συνοψίζοντας, η μελέτη των υδροαλκοολικών εκχυλισμάτων των ριζών της E. purpurea που καλλιεργήθηκε στην Ελλάδα, δείχνουν ότι είναι πλούσιες σε φαινολικά συστατικά με αντιοξειδωτική δράση και κυρίως σε κιχορικό οξύ, μόριο με πολλές βιολογικές δράσεις.

Echinacea purpurea is a medicinal plant the cultivation of which was recently practiced in Greece. In order to study the hydroalcoholic extracts from the roots of E. purpurea 0,5g of fine ground roots were extracted with 10mL CH 3 OH:H O system at various concentrations with stirring at room temperature for 15 min with or without the use of ultrasounds. The extraction progress was monitored by measuring the absorbance of the extracts at 330nm. The kinetic of the extraction was studied for both methods using the 70:30 solvent system which had given optimal yields. It was concluded that four extractions are required to receive yields above 95% of the total phenolic content of the plant roots. 2 Qualitative and quantitative analysis of the total phenolic content of root extracts and of two commercial preparations was performed with High Performance Liquid Chromatography (HPLC) and Liquid Chromatography coupled with Mass Spectometry (LC-MS). Caffeic acid, caftaric acid and chicoric acid were used as standards. Independently from the extraction method used, caftaric and chicoric acid were identified in al root extracts at concentrations from 16,66 to 18,00mg/g dry root amount which did not significantly decrease after a short period of extract storage at -20°C. Results from LC-MS analysis indicated also the presence of chlorogenic acid and cynarin. The commercially available preparations analysed had a content of caftaric and chicoric acid varying from 8,09 to 9,03 mg/g dry plant tissue, which was much lower than the amount detected in the hydroalcoholic extracts. Echinacoside and cynarin were both identified in commercial preparations with LC-MS analysis while chlorogenic acid was identified only in one of them. In addition, total phenolic content of all samples analysed was estimated with the Folin-Ciocalteu assay. Scavenger activity was estimated by studying the sample quenching capacity towards the stable radical DPPH. All results were expressed in terms of gallic acid equivalents. The results of the Folin assay showed that the classic method was equally efficient with the ultrasound assisted method (29,05±2,18mg of total phenolics/g dry root). It was also shown that commercial preparations had a phenolic content at lower concentrations (8,66±0,28mg/g). For the antioxidant capacity estimation EC values were compared to those of known antioxidants. EC 50 50 values fluctuated between 2,87 and 4,2ppm of gallic acid equivalents, indicating substantial antioxidant capacity. The above data indicate that the highest antioxidant capacity and the highest phenolic content was observed in the classic method extract. Finally the FT-IR spectra of ground E. purpurea roots was recorded in Diffuse Reflectance Infrared Fourier Transform (DRIFT) spectroscopy mode and those of the extracts in Attenuated Total Reflectance (ATR) spectroscopy mode. The peak at 1510-1520cm -1 which is directly associated with the phenolic content of a sample was of high intensity in all samples. It seems that there is a direct correlation between the course of extraction of total phenolic content and the intensity of the 1510-1520cm -1 peak. Such observation could be exploited for the development of a new quantitative method with applicability to the determination of total phenolics. As a conclusion, the present study showed that E. purpurea root extracts, are rich in phenolic acids and especially in chicoric, compound with high antioxidant potential.