Διερεύνηση του κινδύνου εμφάνισης ανθεκτικότητας στο μύκητα Penicillium epansum σε νέους παρεμποδιστές της αφυδρογονάσης του ηλεκτρικού οξέος.

Abstract

Στελέχη του μυκοτοξικογόνου μύκητα Penicillium expansum με υψηλό επίπεδο ανθεκτικότητας (Rf≥300) στους νέους Παρεμποδιστές της Αφυδρογονάσης του Ηλεκτρικού Οξέος (Succinate Dehydrogenase Inhibitors-SDHIs) απομονώθηκαν σε συχνότητα 106 μετά από μεταλλαξιγένεση με υπεριώδη ακτινοβολία (UV) και επιλογή σε υλικό που περιείχε boscalid. Πειράματα διασταυρωτής ανθεκτικότητας έδειξαν ότι οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα στο boscalid στο isopyrazam μειώνουν την ευαισθησία όλων των μεταλλαγμένων στελεχών (Rf ≥30), ενώ στο fluopyram μόνο σε ορισμένα στελέχη (Rf: 8≤10). Αντίθετα σε κάποια στελέχη η ευαισθησία στο fluopyram αυξάνεται (Rf: 0,2≤0,3). Οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα στο boscalid δε φαίνεται να επηρεάζουν την ευαισθησία των μεταλλαγμένων στελεχών σε μυκητοκτόνα που δρουν σε άλλες βαθμίδες του κυτταρικού μεταβολισμού, όπως τα τριαζολικά, τα φαινυλοπυρρολικά και τα βενζιμιδαζολικά. Αρνητική διασταυρωτή ανθεκτικότητα (Rf: 0,3≤0,1) διαπιστώθηκε με τον παρεμποδιστή του συμπλόκου ΙΙΙ (QoI) της μιτοχονδριακής αναπνοής pyraclostrobin. Μελέτη της προσαρμοστικότητας των ανθεκτικών στο boscalid στελεχών έδειξε πως οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα στους SDHIs φαίνεται να επηρεάζουν ή να μην επηρεάζουν τη μυκηλιακή αύξηση, ενώ δε φαίνεται να επηρεάζουν την παραγωγή και βλάστηση των κονιδίων, την παθογόνο ικανότητα και δύναμη και την ευαισθησία των στελεχών στην ωσμωτική πίεση. Αναλύσεις εκχυλισμάτων από καλλιέργειες των αγρίων και των ανθεκτικών στο boscalid στελεχών του P. expansum με χρωματογραφία λεπτής στοιβάδας (TLC) και με υγρή χρωματογραφία υψηλής απόδοσης (HPLC), έδειξε πως οι μεταλλαγές για ανθεκτικότητα στο boscalid στα περισσότερα στελέχη που μελετήθηκαν αυξάνουν την ικανότητα παραγωγής μυκοτοξινών (πατουλίνη και κιτρινίνη), ενώ στα υπόλοιπα την μειώνουν έως και σταματούν. Ανάλογα αποτελέσματα διαπιστώθηκαν και σε εκχυλίσματα από μήλα που είχαν τεχνητώς μολυνθεί με στελέχη του μύκητα. Μοριακή διερεύνηση του βιοχημικού μηχανισμού της ανθεκτικότητας, με απομόνωση της Β υπομονάδας του συμπλόκου ΙΙ, αποκάλυψε υποκαταστάσεις της ιστιδίνης της θέσης 272 του γονιδίου. Σε 3 περιπτώσεις βρέθηκε αντικατάσταση από τυροσίνη (H272Y), η οποία προσδίδει και αυξημένη ευαισθησία στο fluopyram, ενώ σε 1 περίπτωση βρέθηκε αντικατάσταση της ιστιδίνης από αργινίνη (H272R), η οποία δε φαίνεται να επηρεάζει την ευαισθησία στο fluopyram. Σε 1 περίπτωση δεν εντοπίστηκε μεταλλαγή στην Β υπομονάδα του συμπλόκου ΙΙ, όμως το στέλεχος παρουσίασε υψηλή ανθεκτικότητα στο boscalid (Rf=300) και μέτρια ανθεκτικότητα στο fluopyram (Rf=10). Τα αποτελέσματα της παρούσας μελέτης φανερώνουν ότι μη ορθή χρήση των νέων SDHIs ενέχει αυξημένο κίνδυνο εμφάνισης και επικράτησης ανθεκτικών στελεχών του μύκητα P. expansum στην αγροτική πράξη.

Mutants of the mycotoxigenic fungus Penicillium expansum highly resistant (Rf≥300) to the new Succinate Dehydrogenase Inhibitors (SDHIs) were isolated at a mutation frequency of 10 6 after UV-mutagenesis and selection on media containing boscalid. Cross resistance studies with other fungicides showed that the mutations for resistance to boscalid also reduced sensitivity to isopyrazam (Rf ≥30) and, on some cases, to fluopyram (Rf: 8≤10). On some strains, sensitivity to fluopyram was increased (Rf: 0,2≤0,3). No effect of boscalid resistance mutation(s) were observed on the fungitoxicity of triazoles, phenylpyrroles and benzamides. However, an increased sensitivity (Rf: 0,3≤0,1) of boscalid-resistant strains to the strobilurin-type fungicide pyraclostrobin was observed in all mutant strains tested. Studies of fitness determining parameters showed that the mutation(s) for resistance to boscalid may or may not affect mycelial growth rate, though no effects were observed on sporulation, conidial germination, pathogenicity, virulence and osmosensitivity. Analysis of mycelial extracts from the wild types and mutant strains, using thin layer chromatography (TLC) and high performance liquid chromatography (HPLC), showed that most P. expansum mutant strains produced mycotoxins (patulin and citrinin) at significantly higher concentrations than the wild-type parent strains. However some strains produced significantly lower or no mycotoxins at all. Similar results were found in tests with artificially inoculated apples. Gene sequence analysis of the subunit B gene of complex II, revealed single point mutations in a highly conserved region of the iron-sulphur protein (Ip) conferred resistance in most cases. Mutations resulted to histidine to arginine (H272R) or tyrosine (H272Y) replacements at position 272. The H272R mutation (1 case) had no effect on the strains’ sensitivity to fluopyram, while the H272Y mutation (3 cases) induced increased sensitivity to fluopyram. However, on one strain no mutations were found in the Ip gene, though the strain showed high resistance to boscalid (Rf=300) and medium-high resistance to fluopyram (Rf=10). The data of the present study indicate the potential increase in resistance incidence of P. expansum strains after intensive use of new SDHIs.