Διερεύνηση του μηχανισμού της βακτηριοκτόνου δράσης του αντιμικροβιακού πεπτιδίου μασεδοσίνη που παράγεται από το Streptococcus macedonicus ACA-DC 198

Abstract

Οι καινοτόμοι ή εναλλακτικοί αντιμικροβιακοί παράγοντες έχουν εξαιρετικά μεγάλη σημασία στις μέρες μας, λόγω της εκτεταμμένης εμφάνισης ανθεκτικότητας των βακτηρίων στα αντιβιοτικά. Τα οξυγαλακτικά βακτήρια είναι γνωστό εδώ και καιρό ότι παράγουν τέτοιες ενώσεις, με πιθανές εφαρμογές στους τομείς των τροφίμων και της βιοϊατρικής. Η μασεδοσίνη είναι μία βακτηριοσίνη-πεπτίδιο με ευρύ βακτηριοκτόνο φάσμα, που παράγεται από τον Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, ένα βακτήριο συμβατό με τα τρόφιμα, το οποίο απομονώθηκε από το φυσικά ζυμωμένο Ελληνικό τυρί Κασσέρι. Η παρούσα μελέτη έχει στόχο να αποσαφηνίσει τον τρόπο δράσης της μασεδοσίνης, διερευνώντας τους μηχανισμούς αναγνώρισης και θανάτωσης των κυττάρων-στόχων. Ο Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363 , ο μικροοργανισμός-μοντέλο για τα οξυγαλακτικά βακτήρια, εκδηλώνει μία έμφυτη ευαισθησία στη μασεδοσίνη. Χρησιμοποιήσαμε τον πλασμιδιακό φορέα pGh9:ISS1 για να κατασκευάσουμε μία τυχαιοποιημένη βιβλιοθήκη από μεταλλαγμένα στελέχη του L. lactis ssp. cremoris MG1363. Η βιβλιοθήκη δοκιμάστηκε σε διάφορες ανασταλτικές συγκεντρώσεις βακτηριοσίνης, με αποτέλεσμα να απομονωθούν 64 σταθερά μεταλλαγμένα στελέχη, ανθεκτικά στη μασεδοσίνη. Ο προκαταρκτικός χαρακτηρισμός αυτών των μεταλλαγμένων στελεχών με πειράματα κλωνοποίησης και διάσωσης του πλασμιδίου που έφερε την πλευρική αλυσίδα από το χρωμοσωμικό DNA των μεταλλαγμένων στελεχών έδειξαν ότι στην πλειοψηφία των περιπτώσεων διακόπηκε στο γονίδιο των ABC-μεταφορέων που εμπλέκονται στη δέσμευση του φωσφόρου, σε κάποια στελέχη διακόπηκε το οπερόνιο του συστήματος μεταφοράς φρουκτόζης/μαννιτόλης PTS (mtl) και στο μεταβολισμό των σακχάρων (fruR), εμπλέκοντας έτσι τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούνται στην εμφάνιση του ανθεκτικού φαινότυπου. Επιπλέον, σε πολλές περιπτώσεις η ενσωμάτωση του πλασμιδίου στο γονιδίωμα του L. lactis ssp. cremoris MG1363 πραγματοποιήθηκε σε γενετικούς τόπους που έχουν σχέση με τη βιοσύνθεση του κυτταρικού φακέλου ενώ βρέθηκαν και γενετικοί τόποι που ρυθμίζουν το οπερόνιο της τρεχαλόζης (tre) και την ανθεκτικότητα σε διάφορα αντιβιοτικά. Τέλος, βρέθηκαν και δύο γενετικοί τόποι, οι οποίοι αντιστοιχούν σε γονίδια, των οποίων η λειτουργία δεν είναι ακόμα γνωστή. Η μελέτη αυτή ελπίζουμε να αποσαφηνίσει τον τρόπο δράσης της μασεδοσίνης, σε μοριακό επίπεδο.

Novel or alternative antimicrobial agents are nowadays of outmost importance due to the extended emerging of bacteria’s antibiotic resistance. Lactic acid bacteria have been known for long to produce such substances with potential applications for the food and the biomedical sectors. Macedocin is a peptide-bacteriocin with a broad bacteriocidal spectrum produced by Streptococcus macedonicus ACA-DC 198, a food-grade isolate from naturally fermented Greek Kasseri cheese. Τhe current study aims to unravel the mode of action of macedocin by investigating the mechanisms of target cells’ recognition and subsequent killing. Lactococcus lactis ssp. cremoris MG1363, the ‘model’ organism for lactic acid bacteria, exhibits an inherent sensitivity to macedocin. We employed the pGh9:ISS1 vector to construct a randomized library of L. lactis insertional mutants. The library was screened against several inhibitory concentrations of the bacteriocin, resulting in the isolation of 64 stable mutants resistant to macedocin. Preliminary characterization of these mutants with ‘plasmid rescue’ experiments showed that the majority of them were disrupted in the fructose/mannitol PTS operon (mtl), and the sugar metabolism (fruR), thus implicating these proteins in the resistance phenotype. Furthermore, in many cases, insertion of the vector was traced back in loci of L. lactis ssp. cremoris MG1363 chromosome that are dedicated to cell wall biosynthesis, while loci that regulate the trehalose operon (tre) and the antibiotic resistance were also found to have been disrupted Finally, two loci were traced back, that correspond to genes whose function is not known yet. Our ongoing investigation will shed light into the molecular aspects of macedocin’s action.