Μελέτη της καρβοξυκινάσης του φωσφορο-ενολοπυροσταφυλικού οξέος (PEPCK) σε παρθενοκαρπικούς και ένσπερμους καρπούς τομάτας κατά τη διάρκεια της ανάπτυξής τους

Abstract

Η καρβοξυκινάση του φωσφοροενολοπυροσταφυλικού (PEPCK), είναι ένζυμο-κλειδί της γλυκονεογένεσης. Στον καρπό της τομάτας η συγκέντρωση των οργανικών οξέων (μηλικού και κιτρικού) αυξάνεται έως το στάδιο της αλλαγής του χρώματος του καρπού και μετά μειώνεται. Στο ζελατινώδες παρέγχυμα η συγκέντρωση των οξέων είναι πολλαπλάσια από ότι σε άλλους ιστούς. Επιπλέον, οι παρθενοκαρπικοί καρποί παρουσιάζουν ελάχιστη ανάπτυξη του ζελατινώδους παρεγχύματος. Οι παρθενοκαρπικοί καρποί αναπτύχθηκαν μετά την αφαίρεση των ανθήρων κλειστών ανθέων με την εφαρμογή 50ppm β-ΝΟΑ. Το ένζυμο μελετήθηκε σε παρθενοκαρπικούς και ένσπερμους καρπούς τομάτας τύπου cherry στα ακόλουθα στάδια ωρίμανσής τους: νεαροί, ανώριμοι πράσινοι (διαμέτρου 5mm και 15mm), ώριμοι πράσινοι, κατά την αλλαγή του χρώματος και ώριμοι κόκκινοι καρποί. Για τον ανοσοεντοπισμό του ενζύμου χρησιμοποιήθηκε 1:1000 αντι-PEPCK (AS07241, Agrisera). Ως μάρτυρας, χρησιμοποιήθηκε ορρός κουνελιού προ της δημιουργίας των αντισωμάτων. Το δευτερογενές αντισώμα έφερε συνδεδεμένη την αλκαλική φωσφατάση και η PEPCK εντοπίστηκε μετά τη χρωματική αντίδραση με 5–βρωμο-3-χλωρο-ινδολυλο-φωσφορικό (BCIP) και νιτρομπλέ του τετραζολίου (NBT). Σήμα εντοπίστηκε στις ηθμαγγειώδεις δεσμίδες, στις σπερματικές βλάστες /σπέρματα και στο ζελατινώδες παρέγχυμα τόσο των ένσπερμων όσο και των παρθενοκαρπικών καρπών. Όσον αφορά στο σήμα, που παρατηρήθηκε στο ζελατινώδες παρέγχυμα των παρθενοκαρπικών καρπών, ήταν εντονότερο στα τελευταία στάδια ωρίμανσης. Μελέτη της έκφρασης της PEPCK στα διάφορα στάδια ανάπτυξης έδειξε υψηλά επίπεδα μεταγραφημάτων στα τελευταία στάδια ανάπτυξης των ένσπερμων καρπών και στο στάδιο αλλαγής χρώματος των παρθενοκαρπικών καρπών. Τα αποτελέσματα αυτά παραπέμπουν στην πιθανή συμμέτοχή του ενζύμου στη μετατροπή των οργανικών οξέων σε σάκχαρα ιδιαίτερα στα τελευταία στάδια ανάπτυξης του καρπού.

PEP Carboxykinase (PEPCK) is a key enzyme of glyconeogenesis. In tomato fruit the concentration of malic and citric acids increases during the early stages of development, while after the breaker stage it decreases. The highest organic acid concentration has been observed in the locular parenchyma. The development of locular parenchyma in parthenocarpic tomato fruit is much less compared to that in the seeded fruit. PEPCK immunolocalization was studied both in parthenocarpic and seeded tomato cherry fruit in young immature green fruits of 5mm and 15 mm in diameter, mature green, breaker and red ripe. Parthenocarpic fruits were developed by the applicat ion of 50 ppm β-naphthoxyacetic acid on emasculated closed flowers. For the immunolocalization of the enzyme a dilution 1:1000 anti PEPCK (AS07241, Agrisera) was used. Rabbit preimmune serum was used as a control, and as a secondary antibody AP-Anti-Rabbit, Promega was applied. The immunodetection signal was localised in the locular parenchyma, in the vascular bundles and in the embryo organs of seeded and parthenocarpic fruits. The presence of the enzyme in the locular parenchyma of the parthenocarpic fruits was more intense at the latter stages of the fruit development. Real time PCR revealed that transcripts of PEPCK gene were accumulated at later development stages of seeded fruits and at the breaker stage of parthenocarpic fruits. These results point to the probable contribution of PEPCK enzyme to the conversion of organic acids into carbohydrates especially during the latter stages of tomato fruit development.