Οι βιοχημικές αλλαγές καθώς και τα επαγόμενα υπό την επίδραση των αβιοτικών
καταπονήσεων γονίδια αποτελούν αντικείμενο έρευνας, με απώτερο στόχο τη
δημιουργία ανθεκτικών διαγονιδιακών φυτών. Οι βακτηριακής προέλευσης πρωτεΐνες-
χαρπίνες (Hrp) έπειτα από την ενσωμάτωσή τους σε φυτά είναι ικανές να επάγουν
γονίδια σχετιζόμενα με την άμυνα ενάντια σε βιοτικούς και αβιοτικούς παράγοντες
καταπόνησης. Προκειμένου να μελετηθεί ο ρόλος της πρωτεΐνης HrpZPsph, του
βακτηρίου Pseudomonas syringae pv. phaseolicola κάτω από συνθήκες αβιοτικών
καταπονήσεων, παράχθηκαν διαγονιδιακά φυτά του είδους Nicotiana benthamiana. Τα
διαγονιδιακά φυτά (Τ2 γενιά) που εξέφραζαν το γονίδιο hrpΖPsph αξιολογήθηκαν σε
μορφολογικό και αναπτυξιακό επίπεδο σε σύγκριση με φυτά- μάρτυρες και ακολούθησε
έλεγχος για την επαγωγή γονιδίων εμπλεκόμενων με γνωστά μονοπάτια άμυνας των
φυτών. Για την αξιολόγηση των μετασχηματισμένων φυτών πραγματοποιήθηκε
πολλαπλή PCR αντίδραση για την ενίσχυση του διαγονιδίου hrpZPsph και της περιοχής
virG του Α. tumefaciens, RT-PCR για τον έλεγχο της έκφρασης του διαγονιδίου και
ανοσοανίχνευση κατά Western για την ανίχνευση και ποσοτικοποίηση της παραγόμενης
πρωτεΐνης. Ο μετασχηματισμός επιβεβαιώθηκε σε όλα τα φυτά που εξετάστηκαν τόσο
με την ένθεση του διαγονιδίου hrpZPsph όσο και με την επιτυχή μεταγραφή και
μετάφραση του στην πρωτεΐνη HrpZPsph. Προκειμένου να αξιολογηθεί η ανθεκτικότητα
των διαγονιδιακών φυτών έναντι αβιοτικών καταπονήσεων, τα φυτά υπεβλήθησαν σε
τέσσερις παράγοντες καταπόνησης (αλατότητα, ακραίες υψηλές και χαμηλές
θερμοκρασίες, επίδραση ακτινοβολίας UV-B). Σε όλα τα πειράματα συμπεριλήφθηκαν
και φυτά αγρίου τύπου ως μάρτυρες. Η απόκριση των διαγονιδιακών φυτών στα υπό
μελέτη ερεθίσματα αξιολογήθηκε σε σύγκριση με φυτά- μάρτυρες με τον έλεγχο της
επαγωγής γονιδίων που εμπλέκονται με γνωστά βιοχημικά μονοπάτια άμυνας των
φυτών, διαμέσου αντιδράσεων RT-PCR σε διαφορετικούς κύκλους ενίσχυσης.
Ακολούθησε μεταβολομική ανάλυση (GC-MS) για τον προσδιορισμό του μεταβολικού
προφίλ των διαγονιδιακών φυτών σε σύγκριση με αυτό των φυτών- μαρτύρων. Η
ενδογενής έκφραση της χαρπίνης στην εκκρινόμενη μορφή της εξωκυτταρικά (SPHrpZPsph)
επέδρασε θετικά στο φαινότυπο και το ρυθμό ανάπτυξης των φυτών. Η
ανάλυση μεταγραφημάτων που σχετίζονται με την άμυνα των φυτών κατέδειξε την
επαγωγή της έκφρασης των γονιδίων Col1, hin1, PR1a, PR1b και AOX στα διαγονιδιακά
φυτά. Κατά τη μεταβολομική ανάλυση, σημειώθηκε αυξημένη συσσώρευση των
μεταβολιτών: 2-κετο-L-γουλονικό οξύ, γαλακτουρονικό οξύ, ραφινόζη, θρεόζη,
πορφίνη, γλυκονικό οξύ της λακτόνης και διπεπτίδιο της D-αλανίνης στα διαγονιδιακά
φυτά σε σύγκριση με τα φυτά-μάρτυρες.
The biochemical alterations as well as the study of genes which are induced by abiotic
stresses constitute a field of constant research, finally aiming at the development of
genetically resistant varieties. Harpins constitute a class of bacterial proteins which upon
integration into the plant genome are capable of inducing genes related to the resistance
mechanisms against both biotic and abiotic stresses. To explore possible sources of broad
spectrum transgenic resistance to various abiotic stresses, the HrpZPsph protein from
Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was expressed in N. benthamiana plants. Transgenic
plants (T2 generation) were evaluated at the morphological and physiological level in
comparison with wild-type control plants. At the same time, transgenics were evaluated by
means of PCR for the amplification of the transgene hrpZPsph, RT-PCR for the amplification
of the gene transcript and Western blot analysis for the detection and quantification of the
foreign protein. Transgene integration and expression was confirmed in all primary
transformants whereas at the same time, immunoblot analysis revealed that HrpZPsph was
produced. Transgenic plants (T2) were subjected to a series of abiotic stresses (extreme high
and low temperatures, high salinity and UV radiation). Wild type plants of the same age
were included as control in all experiments. Following abovementioned treatments, the
activation of plant defence pathways, due to harpin expression, was examined by an RT-PCR
assay, performed in different amplification cycles. Total RNA was extracted from both
stressed and control plants and was subsequently subjected to reverse transcription and RTPCR.
The expression of known defence-associated genes was determined as a means to
partially profile the transcriptome of transgenic vs wild type plants. In order to profile
metabolites in transgenic and control plants, metabolites were extracted from leaves of both
stressed and non-stressed plants and subsequently analysed using Gas-chromatography
coupled to Mass-spectrometry (GC-MS). Endogenous expression of harpin in its secreted
form (SP-HrpZPsph) demonstrated a positive effect on phenotype and growth rate of plants.
The analysis of transcripts associated with plants’ defense indicated the induction of gene
expression Col1, hin1, PR1a, PR1b and AOX in transgenic plants. Finally, metabolomic
analysis revealed higher accumulations of specific metabolites in transgenic plants,
compared to control plants, such as: 2-keto-L-gulonic acid, galacturonic acid, raffinose,
threose, porphine, gluconic acid lactone and dipeptide of D-alanine.
