Ανάπτυξη μεθόδων λύσης βακτηριακών κυττάρων.

Abstract

Σκοπός της παρούσας εργασίας ήταν η μελέτη και ο χαρακτηρισμός δύο νέων βακτηριοφάγων (ALMC, CHOED), οι οποίοι μολύνουν το βακτήριο Vibrio anguillarum στέλεχος Pf4. Στην παρούσα μελέτη παρατηρήθηκε ότι οι βακτηριοφάγοι (ALMC, CHOED) αναστέλλουν την ανάπτυξη του βακτηρίου Vibrio anguillarum στέλεχος Pf4. Η αποτελεσματικότητα των βακτηριοφάγων επηρεάζεται τόσο από την ποσότητα και συγκέντρωση των βακτηριοφάγων που προστίθενται όσο και από το χρονικό σημείο ανάπτυξης στο οποίο προστίθενται στην καλλιέργεια του βακτηρίου. Επίσης, παρατηρήθηκε ότι και τα δύο βακτήρια, αν και αρνητικά κατά Gram, είναι ευαίσθητα στο ένζυμο λυσοζύμη τύπου C, με την αποτελεσματικότητα της λύσης των κυττάρων να επηρεάζεται από την αρχική συγκέντρωση των βακτηριακών κυττάρων στην αντίδραση λύσης και από την ποσότητα του ενζύμου. Επιπλέον, παρατηρήθηκε ότι και η συγκέντρωση NaCl αλλά και η τιμή του pH επηρεάζουν την αντίδραση λύσης με τις βέλτιστες τιμές αντίδρασης να είναι 0mM NaCl και pH6,24 και για τα δύο βακτήρια. Επιπλέον μελετήθηκαν τα νουκλεϊκά οξέα των δύο νέων βακτηριοφάγων. Για τον σκοπό αυτό έγινε απομόνωση, πέψη με περιοριστικό ένζυμο, κλωνοποίηση τυχαίων τμημάτων μήκους 2kbp, 3kbp και 4kbp σε πλασμιδιακό φορέα, μετασχηματισμός δεκτικών κυττάρων και απομόνωση των ανασυνδιασμένων πλασμιδιακών φορέων βρέθηκε ότι το γονιδιωματικό υλικό του βακτηριοφάγου CHOED είναι δίκλωνο, δεοξυριβονουκλεϊκό οξύ μεγέθους τουλάχιστον 22kbp.

The aim of this work was the study and characterization of two new bacteriophage (ALMC, CHOED), which infect the bacterium Vibrio anguillarum strain Pf4. In this study, we observed that bacteriophages ALMC and CHOED can inhibit the bacteria host Vibrio anguillarum strain Pf4, with CHOED being more effective. The effectiveness of bacteriophages to inhibit bacteria is influenced by the concentration of the bacteriophage solution being added and the time being added in bacterial culture. We also observed that both bacteria, although Gram negative, are susceptible to the enzyme lysozyme type C. Furthermore, it was observed that the concentration of NaCl and the pH affect the bacterial lysis by enzyme lysozyme, with the optimimal conditions being 0mM NaCl and pH6, 24 for both bacteria. Moreover we studied the nucleic acids of the two new bacteriophages. The whole genome was extracted and digested with restriction enzyme EcoRV. The genome of bacteriophage CHOED is double stranded, deoxyribonucleic acid of at least 22 kbp in length. Random segments of bacteriophage DNA (2kbp, 3kbp and 4kbp length) were cloned in plasmid vectors, transformed in competent cells.