Μελέτη της επίδρασης της γήρανσης και του αντιοξειδωτικού τρογλιταζόνη στην οξείδωση κάλλων Arabidopsis thaliana

Abstract

Στόχος του πειράματος είναι η μελέτη της επίδρασης των παραγόντων της γήρανση και της τρογλιταζόνης στο οξειδωτικό στρες των φυτικών κυττάρων. Καλλιεργήθηκαν κάλλοι Arabidopsis thaliana, δημιουργώντας μια χρονοσειρά ηλικιών δύο έως δώδεκα μηνών. Παράλληλα, κάλλοι δύο και τεσσάρων μηνών αναπτύχθηκαν σε θρεπτικό μέσο που είχε εμπλουτιστεί με τρογλιταζόνη, σε δύο διαφορετικές συγκεντρώσεις 10nM και 10μΜ. Για να εκτιμηθεί η επίδραση των δύο παραγόντων στις μεταβολικές διεργασίες, μετρήθηκε αρχικά η εξέλιξη της συγκέντρωσης πρωτεϊνών. Εφαρμόστηκε η μέθοδος Bradford, στη χρονοσειρά κάλλων και σε αυτούς με την επίδραση τρογλιταζόνης. Στη συνέχεια, στο ίδιο φυτικό υλικό, υπολογίστηκε η συγκέντρωση των ομάδων καρβονυλίων, που αποτελεί πολύ καλό μέτρο για την εκτίμηση της οξείδωσης των πρωτεϊνών. Η παρουσία ενεργών μορφών οξυγόνου, προσδιορίστηκε φθορισμομετρικά, με χρήση της χρωστικής 2,7-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA). Ο παράγοντας ηλικία μελετήθηκε ως προς την ικανότητα βιοσύνθεσης πρωτεϊνών και στις οξειδωτικές διεργασίες. Παρατηρείται, ότι υπάρχει ένα κρίσιμο διάστημα μεταξύ του έκτου και όγδοου μήνα καλλιέργειας, όπου επηρεάζεται η ικανότητα βιοσύνθεσης πρωτεϊνών και η παρουσία καρβονυλίων σε αυτές. Η παρουσία ενεργών μορφών οξυγόνου αυξάνει σταθερά μέχρι τον όγδοο μήνα και στη συνέχεια σταθεροποιείται. Η τρογλιταζόνη επιδρά ανάλογα με την ηλικία του κάλλου και η επίδραση αυτή εξαρτάται από τη συγκέντρωση της. Σε κάλλους δύο μηνών επιδρά θετικά στη βιοσύνθεση πρωτεϊνών και έχει αντιοξειδωτική δράση αφού εμφανίζονται μειωμένες ποσότητες καρβονυλίων και ROS, ειδικά όταν εφαρμόζεται η συγκέντρωση 10nM.

Callus tissues of the model plant Arabidopsis thaliana, growing for a period of two to twelve months, have been cultured in B5 culture media supplemented 0,5mgr/lt 2,4-D and 0,05mgr/lt kinetin. Troglitazone was added in the same media, at two different concentrations (10nM and10μΜ) in order to obtain callus lines aging for two and four months in each application. Total protein content was estimated using the Bradford micro assay, a simple and accurate procedure for determining concentration of solubilised proteins. Carbonyl content in oxidatively modified proteins was determined by a spectrophotometric assay involving the carbonyl reagent 2,4-Dinitrophenylhydrazine, which leads to the formation of a stable 2,4-dinitrophenyl (DNP) hydrazone product. ROS production was investigated by spectrophotometric analysis using the dye 2,7-dichlorofluorescein diacetate (H2DCFDA). Callus aging was studied for the capacity of protein biosynthesis and oxidative alterations. There was a threshold between the sixth and eighth month of culture growth, where alterations in protein accumulation and the content of carbonyl group were observed. The presence of reactive oxygen species increased steadily until the eighth month and then was stabilized. Troglitazone effect was age-dependent and inversely proportional to the applied concentration. In young callus the present of 10 nM of troglitane stimulated protein biosynthesis and reduced oxidant compounds as carbonyl groups and ROS.