Βελτιστοποίηση συνθηκών καθαρισμού της πρωτεϊνης NopT1 του Bradyrhizobium japonicum και διερεύνηση πρωτεϊνικών αλληλεπιδράσεών της με πρωτεΐνες της σόγιας

Abstract

Many Gram negative bacteria, whether they are pathogens or symbionts to plants, insects or animals, have developed complicated mechanisms to deliver multiple, bacterial encoded proteins into eukaryotic cells. Secreted proteins are able to modify a wide range of cellular functions and are widely known as effector proteins or effectors. Each effector has a specialized function and specific targets in the host cell, modifying frequently basic functions of the host cell. In the present tudy, NopT1 was studied as an effector protein secreted by type III secretion system, from the bacterium Bradyrhizobium japonicum to soybean, Glycine max. Initially, we optimized the expression and extraction of the NopT1 in the E.coli system after its expression through pET28a-GST vector, in which the nopT1 coding sequence was cloned in frame with the coding sequence of the glutathione transferase (GST). The result was the efficient expression of NopT1 and its easy extraction under native conditions, suggesting that the GST epitope positively affectedthe protein solubility. Previous studies provided evidence that the first 49 aminoacid residues of the protein may harbor a chaperone activity. In the present study, this was verified by cloning the protein coding sequence in pET28a-GST in such a way that the hybrid protein is fused to to a His tag (6 Histidines) in the N-terminal end and a GST tag in the C-terminal end. The specific protein extraction methods based on these tags indicated the probable interaction between the two parts of the protein, giving a hint for the possible function of the first 49 protein aminoacids as chaperones of the functional part of the protein. The next step was to apply bioinformatics in order to find possible NopT1 target-proteins in soybean. This study was based in AvrphB-PBS1 interaction in Pseudomonas-Arabidopsis pathosystem and resulted in 13 soybean proteins as potential targets of NopT1. Since two out of thirteen were the best candidates, we tried to prove experimentally the interaction of these proteins with the NopT1. Lastly, to facilitate the interaction analysis and the subcloning of the possible NopT1 target-proteins we made a specific vector for the cloning of the desired sequences via Gateway technology. Vector functionality was verified experimentally by subcloning the GFP coding sequence into the vector.

Πολλά αρνητικά κατά Gram βακτήρια, είτε παθογόνα είτε συμβιωτικά για φυτά, έντομα ή ζώα έχουν αναπτύξει πολύπλοκες μηχανές για να μεταφέρουν πολλαπλές, βακτηριακά κωδικοποιούμενες πρωτεΐνες στα ευκαρυωτικά κύτταρα. Οι εκκρινόμενες πρωτεΐνες έχουν την ικανότητα να τροποποιούν ένα εύρος κυτταρικών λειτουργιών και είναι ευρύτερα γνωστές ως «πρωτεΐνες τελεστές». Η κάθε πρωτεΐνη τελεστής έχει εξειδικευμένη δράση και συγκεκριμένους στόχους στο κύτταρο του ξενιστή τροποποιώντας πολλές φορές λειτουργίες ζωτικής σημασίας του κυττάρου ξενιστή. Στην παρούσα μεταπτυχιακή διατριβή έγινε μελέτη της πρωτεΐνης-τελεστή NopT1 που εκκρίνεται, μέσω του εκκριτικού συστήματος τύπου ΙΙΙ, από το βακτήριο Bradyrhizobium japonicum στη σόγια, Glycine max. Αρχικά έγινε βελτιστοποίηση της έκφρασης και του καθαρισμού της πρωτεΐνης στο E. coli μετά από έκφραση της στον φορέα pET28a-GST, όπου κλωνοποιήθηκε η κωδικοποιούσα για την πρωτεΐνη αλληλουχία σε κοινό πλαίσιο ανάγνωσης με τον επίτοπο της τρανσφεράσης της γλουταθειόνης (GST). Το αποτέλεσμα ήταν η αποδοτικότερη έκφραση της πρωτεΐνης NopT1 και ο εύκολος καθαρισμός της υπό φυσικές συνθήκες, υποδηλώνοντας με αυτόν τον τρόπο τη θετική δράση του επιτόπου GST στη διαλυτότητα της πρωτεΐνης. Προηγούμενες μελέτες έδωσαν ενδείξεις για την πιθανή δράση των πρώτων 49 αμινοξικών καταλοίπων της NopT1 ως μοριακή συνοδό της πρωτεΐνης στο κύτταρο του ξενιστή. Στη συγκεκριμένη μελέτη αυτό διαπιστώθηκε μέσω της κλωνοποίησης της κωδικοποιούσας αλληλουχίας της πρωτεΐνης σε φορέα σε κοινό πλαίσιο ανάγνωσης με τους επιτόπους His (6 κατάλοιπα ιστιδίνης) στο αμινοτελικό άκρο της πρωτεΐνης και GST στο καρβοξυτελικό άκρο. Μέσω αυτών των επιτόπων και μετά από τους αντίστοιχους καθαρισμούς έγινε εφικτή η απόδειξη της αλληλεπίδρασης των δύο τμημάτων της πρωτεΐνης δίνοντας έτσι μία ένδειξη για την πιθανή δράση των πρώτων αμινοξικών καταλοίπων της πρωτεΐνης ως μοριακή συνοδό του λειτουργικού της μέρους. Στη συνέχεια εφαρμόστηκαν μέθοδοι βιοπληροφορικής προκειμένου να αναζητηθούν πιθανές πρωτεϊνες-στόχοι της NopT1 στη σόγια. Η μελέτη αυτή βασίστηκε στην αλληλεπίδραση AvrPhB-PBS1 στο παθοσύστημα Pseudomonas-Arabidopsis και υπέδειξε δεκατρείς πρωτεΐνες ως πιθανούς στόχους της NopT1. Επειδή δύο από τις δεκατρείς ήταν οι πιο πιθανές πρωτεΐνες-στόχοι, έγινε προσπάθεια για την πειραματική διαπίστωση της αλληλεπίδρασης τους με την πρωτεΐνη NopT1. Τέλος, για την πιο εύκολη υποκλωνοποίηση των πιθανών πρωτεϊνών στόχων της πρωτεΐνης NopT1 σε φορέα έκφρασης, με σκοπό τον έλεγχο αλληλεπίδρασης, κατασκευάστηκε εξειδικευμένος φορέας έκφρασης γονιδίων στο οποίο είναι εφικτή η κλωνοποίηση των επιθυμητών αλληλουχιών μέσω της τεχνολογίας Gateway. Η λειτουργικότητα του συγκεκριμένου φορέα ελέγχθηκε πειραματικά με την υποκλωνοποίηση της κωδικοποιούσας αλληλουχίας του GFP (green fluorescent protein).