Βιοχημική μελέτη της καλλογένεσης στο φυτό Arabidopsis thaliana με σκοπό τη βελτιστοποίηση του συστήματος καλλιέργειας ώστε να επάγεται η σωματική εμβρυογένεση

Abstract

Στην παρούσα εργασία έγινε προσπάθεια να μελετηθεί η συσχέτιση της σωματικής εμβρυογένεσης με ορισμένες καταστάσεις καταπόνησης των ιστών. Σε κάλλους του Arabidopsis thaliana ύστερα από προμεταχείρισή τους σε υγρό θρεπτικό διάλυμα χωρίς φυτορμόνες αλλά με τις ουσίες κιτρικό οξύ, μαννιτόλη και σπερμίνη ως παράγοντες επαγωγής καταπόνησης έγινε μια σειρά από βιοχημικές αναλύεις. Κρατώντας σταθερή τη συγκέντρωση των παραπάνω ουσιών αλλά μεταβάλλοντας τη χρονική διάρκεια της έκθεσης στην καταπόνηση μετρήθηκαν η έκταση της οξείδωσης λιπιδίων, ο λόγος ανηγμένης προς οξειδωμένη γλουταθειόνη και η ενεργότητα του ενζύμου της σουπεροξειδικής δισμουτάσης (SOD). Επίσης στα προσχεδιασμένα χρονικά διαστήματα τα οποία είναι 1, 6, 12 και 24 ώρες μετά τον εμβολιασμό, μετρήθηκαν το pH και η αγωγιμότητα των διαλυμάτων προμεταχείρισης καθώς επίσης και η συγκέντρωση των νιτρωδών σε αυτά ώστε να γίνει έμμεση εκτίμηση της παρουσίας του NO στους ιστούς. Παράλληλα και με βάση τον ίδιο σχεδιασμό έγιναν οι αντίστοιχες μετρήσεις χρησιμοποιώντας αντί για κάλλους φυτάρια του υδροχαρούς είδους Lemna minor ώστε μέσω της συγκριτικής παρουσίασής τους να εκτιμηθεί η αλληλεπίδραση των κάλλων του Arabidopsis thaliana με το θρεπτικό μέσο προμεταχείρισης. Κατά τις μακροσκοπικές και μικροσκοπικές παρατηρήσεις της μετέπειτα καλλιέργειας των ιστών σε στερεό υπόστρωμα τα αποτελέσματα συγκρινόμενα με τον μάρτυρα έδειξαν μια σχετικά μεγαλύτερη συχνότητα εμφάνισης εμβρυονικών κάλλων στον χειρισμό με τη μαννιτόλη. Όσο αφορά τις μετρήσεις για τις φυσικοχημικές ιδιότητες των διαλυμάτων προμεταχείρισης είναι δυνατόν να χωριστούνε σε δύο μέρη. Από τη μια μεριά αυτό που φαίνεται να ερμηνεύει την ροπή ορισμένων κυττάρων προς την εγκατάσταση του εμβρυακού προτύπου γονιδιακής έκφρασης και από την άλλη τα δεδομένα που περιγράφουν την αλληλεπίδραση των ιστών με το υγρό θρεπτικό μέσο.

In several in vitro cultures it is possible that embryos be developed from somatic cells either directly from organised tissue or indirectly from callus. This procedure is called somatic embryogenesis and requires the induction of proper conditions so that the tissue can reprogram itself and gets somatic embryos developed. Although it’s hard to say which conditions are proper but data in literature illustrates that pre-treatment in culture media with stress factors can lead to somatic embryogenesis. The aim of this study is to survey if and how the callus pre-treatment with mannitol, citric acid and spermine leads to somatic embryos or relative structures. The concept is to keep the concentration of chemical compounds standard at 1mM for each while changing the time of exposing. The timeline that was kept in this experiment was 1h, 6h, 12h, and 24h and the tissues that were used was callus from Arabidopsis thaliana and plantlets of Lemna minor. To measure the intensity of each stressor three biochemical measurements were run, first lipid oxidation via MDA concentration measurement, second estimation of total glutathione and the ratio of reduced to oxidized glutathione and third the relative activity of SOD via measuring NBT absorbance. Also for the pre-treatment solutions the data about pH and conductivity variance was kept during the time of exposing so that their influence at the tissues can be defined. Finally a differentiated system such as the aquatic plant Lemna minor was used to compare their interaction with liquid media according to the callus’s interaction with it. In parallel, the concentration of nitrites in the solutions was measured as an indirect determination of nitric oxide in the tissues. After the pre-treatment, A. thaliana callus and Lemna minor plantlets were put on solid media with 4,5μM 2,4 D. After three weeks of culture on these media, macroscopic and microscopic observations were taking place every 5 days examining the structure relating to somatic embryogenesis.