Κινητικές και φυσιολογικές μελέτες παραγωγής της 2,3-βουτανοδιόλης κατά την αύξηση επιλεγμένων βακτηριακών στελεχών σε ανανεώσιμες πηγές άνθρακα

Abstract

Στην παρούσα μελέτη εξετάστηκε η ικανότητα 6 βακτηριακών στελεχών της οικογένειας Enterobacteriaceae να μεταβολίζουν χαμηλού κόστους σακχαρούχα υποστρώματα (εμπορική γλυκόζη, εμπορική σακχαρόζη και μελάσα) προς παραγωγή 2,3-βουτανοδιόλης. Τα εξεταζόμενα στελέχη ανήκουν στη συλλογή του εργαστηρίου Μικροβιολογίας και Βιοτεχνολογίας Τροφίμων του τμήματος Επιστήμης και Τεχνολογίας Τροφίμων και απομονώθηκαν από το φλοιό και τη σάρκα των σταφυλιών που είχαν προσβληθεί από το μύκητα Botrytis sp.. Το στέλεχος που επιλέχτηκε για τη συνέχεια της πειραματικής διαδικασίας ήταν το Enterobacter sp. FMCC-208, το οποίο αφομοίωσε πλήρως τα 20 g/L εμπορικής γλυκόζης και παρήγαγε τη μεγαλύτερη ποσότητα της 2,3-βουτανοδιόλης συγκριτικά με τα υπόλοιπα στελέχη. Το επόμενο στάδιο της παρούσας εργασίας αποτέλεσε η διερεύνηση του ρυθμού ανάδευσης στην παραγωγή της 2,3-βουτανοδιόλης και η επίδραση της συγκέντρωσης του υποστρώματος. Όλες οι καλλιέργειες πραγματοποιούνταν σε φιάλες Duran υπό αναερόβιες συνθήκες. Οι ρυθμοί ανάδευσης που επιλέχτηκαν ήταν των 80±5 rpm και των 180±5 rpm και οι καλλιέργειες του στελέχους Enterobacter sp. πραγματοποιηθήκαν σε πηγή άνθρακα την εμπορική γλυκόζη σε αρχική συγκέντρωση 40, 60 και 90 g/L. Τα αποτελέσματα των πειραμάτων έδειξαν πως στον μεγαλύτερο ρυθμό ανάδευσης είχαμε υψηλότερη συγκέντρωση 2,3-βουτανοδιόλης συγκρίνοντας την εκάστοτε αρχική συγκέντρωση και για το λόγο αυτό τα επόμενα πειράματα πραγματοποιηθήκαν υπό αυτές τις συνθήκες ανάδευσης. Όσον αφορά την επίδραση της αρχικής συγκέντρωσης, παρατηρήσαμε πως αύξηση της συγκέντρωσης έως και τα 60 g/L γλυκόζης έχει θετική επίδραση στην παράγωγη της 2,3-βουτανοδιόλης με τον συντελεστή απόδοσης να λαμβάνει τιμή 0.37 g/g ενώ στην καλλιέργεια με αρχική συγκέντρωση γλυκόζης 90 g/L, ο συντελεστής απόδοσης μειώθηκε κατά 0.05 g/g. Κατόπιν, ακολούθησε καλλιέργεια του στελέχους σε εμπορική σακχαρόζη. Η αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης του υποστρώματος (από 20 έως 80 g/L) έδρασε θετικά στην παραγωγή της 2,3-βουταναδιόλης και η μέγιστη συγκέντρωση της παρατηρήθηκε στην καλλιέργεια των 80 g/L, όπου ήταν 29.6 g/L με συντελεστή απόδοσης 0.40 g/g με μέγιστο θεωρητικό τα 0.50 g/g. Δεδομένου των θετικών αποτελεσμάτων που είχαμε στα σακχαρούχα υποστρώματα, ακολούθησε καλλιέργεια σε πηγή άνθρακα τη μελάσα, όπου η παραγωγή της 2,3-βουτανοδιόλης αυξανόταν με την αύξηση της αρχικής συγκέντρωσης (20, 35 και 65 g/L). Η μέγιστη παραγωγή της σημειώθηκε στην καλλιέργεια των 65 g/L με τιμή 25 g/L και ο συντελεστής απόδοσης των καλλιεργειών κυμάνθηκε από 0.42-0.49 g/g με μέγιστο θεωρητικό τα 0.50 g/g. 7 Στο τελευταίο στάδιο της πειραματικής διαδικασίας, μελετήθηκε η αύξηση του μικροοργανισμού σε βιοαντιδραστήρα. Η πηγή άνθρακα που χρησιμοποιήθηκε ήταν η μελάσα και μελετήθηκε η επίδραση του μη-ελεγχόμενου pH σε ασυνεχείς καλλιέργειες με αρχική συγκέντρωση 20 g/L. Το ιδανικό pH για την καλλιέργεια του εν λόγω στελέχους είναι στο εύρος 6.0-6., σε ελαφρώς όξινες συνθήκες. Τέλος πραγματοποιήθηκε ημι-συνεχής καλλιέργεια όπου το pH ελεγχόταν στην τιμή 6.0-6.3 και η παραγόμενη 2,3-βουτανοδιόλη έλαβε τιμή 73.2 g/L με συντελεστή απόδοσης 0.44 g/g ενώ καταναλώθηκαν περίπου 180 g/L μελάσας. Πραγματοποιήθηκε και αποχρωματισμός της μελάσας σε ποσοστό 27%, όπου το αποτέλεσμα κρίνεται ικανοποιητικό αφού οι πειραματικές συνθήκες ευνοούσαν το σχηματισμό της 2,3-βουτανοδιόλης.

At the present study, 6 different bacterial strains that belong to the Enterobacteriaceae family were examined for their ability to convert low-cost sugar-containing substrates (commercial glucose, commercial sucrose and molasses) to 2,3-butanediol. The strains that are investigated are included in the assortment of the Laboratory of Microbiology and Biotechnology of Foods of the Department of Food Science & Technology and they were extracted from the peel and flesh of grapes infested from the fungus Botrytis sp.. A specific strain was selected to continue for further examination, the Enterobacter sp. FMCC-208 which consumed the 20g/L of commercial glucose completely and produced the larger amount of 2,3-butanediol, when compared with the other strains. In addition, the rate of stirring and the concentration of the substrate were checked for their effect on the production of 2,3-butanediol. All the cultivations were taking place in Duran bottles under anaerobic conditions. The different stirring rates were at 80±5 rpm and 180±5 rpm, while the cultivations were applied at commercial glucose in concentrations of 40, 60 and 90 g/L. According to the results, the highest quantity of 2,3-butanediol was produced when stirring with the highest rate for each different concentration and due to this fact, the next experimental procedures were done at this stirring conditions. As far as the initial concentration is concerned, the 40 and 60 g/L of glucose affected positively the production of 2,3-butanediol (YB = 0.37 g/g), while for the 90 g/L the yield of 2,3-butanediol was reduced for 0.05 g/g. The next step was to cultivate the strain at the substrate containing commercial sucrose. The production of 2,3-butanediol was increased in proportion to the substrate’s initial concentration (from 20 to 80 g/L) and the maximum quantity (29.6 g/L) was observed at the culture with 80 g/L (YB = 0.40 g/g). These results leaded to culture containing molasses, where the production of 2,3-butanediol was increased accordingly to the initial concentration (20, 35 και 65 g/L). The maximum concentration of 2,3-BD was observed at the culture of 65 g/L and reached 25 g/L. The 2,3-BD yiels of all cultures was about 0.42-0.49 g/g while the maximum theoretical is 0.50 g/g. BD/Glu Last but not least, the growth of the microorganism in bioreactor was investigated. The molasses was used as carbon resource with the initial concentration of 20 g/L in batch cultures and examined the effect of uncontrolled pH. The ideal pH for the culture of Enterobacter sp. FMCC-208 is at 6.0-6.3. Lastly, it was conducted a fed-batch culture where the pH was 9

BD/Glu controlled at pH=6.0-6.3 and the produced 2,3-butanediol reached the level of 73.2 g/L with YB = 0.44 g/g, while 180 g/L of molasses were consumed. Also the decolourisation of molasses was about 27% and this result is satisfying since the experimental conditions where in favour of the production of 2,3-butanediol.