Αξιολόγηση νέων αναστολέων του RANKL σε κυτταρικές δοκιμές για την εύρεση νέων φαρμάκων στην οστεοπόρωση

Abstract

Η οστεοπόρωση είναι μία μεταβολική ασθένεια των οστών που πλήττει μεγάλο μέρος του πληθυσμού παγκοσμίως, κυρίως γυναικών μετά την εμμηνόπαυση. Στους ασθενείς που πάσχουν από οστεοπόρωση παρατηρείται μείωση της ποσότητας και ποιότητας της οστικής τους μάζας, με συνέπεια τα οστά τους να είναι πιο εύθραυστα και να αυξάνεται ο κίνδυνος καταγμάτων. Οι μελέτες για τα αίτια που προκαλούν την ασθένεια, οδήγησε στο μεταβολικό μονοπάτι που ενεργοποιείται από την πρωτεΐνη RANKL και τον υποδοχέα RANK. Η πρωτεΐνη RANKL, ελέγχει την δράση ειδικών κυττάρων στον οργανισμό, τους οστεοκλάστες, οι οποίοι προκαλούν οστική απορρόφηση και συμμετέχουν στην φυσιολογική διαδικασία της οστικής αναδόμησης. Αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης RANKL οδηγούν σε αύξηση της δράσης των οστεοκλαστών με αποτέλεσμα να διαταράσσεται η ισορροπία της οστικής αναδόμησης και να προκαλείται οστική απώλεια. Ο κεντρικός ρόλος του RANKL στην οστική απώλεια επισφραγίστηκε από τα θεαματικά αποτελέσματα κλινικών δοκιμών ενός μονοκλωνικού αντισώματος, το denosumab, έναντι του RANKL σε οστεοπορωτικές εμμηνοπαυσιακές γυναίκες. Το denosumab αναστέλλει την πρόσδεσή του RANKL στον υποδοχέα RANK και έχει εγκριθεί πλέον για την θεραπεία της οστεοπόρωσης παγκοσμίως. Σε μια προσπάθεια εύρεσης νέων αναστoλέων του RANKL, επικεντρωθήκαμε στο μικρό μόριο SPD-304 που αναστέλλει τον τριμερισμό της πρωτεΐνης TNF και μελέτες μας έδειξαν ότι η δράση του RANKL αναστέλλεται επίσης από το μόριο αυτό το οποίο όμως προκαλεί υψηλή κυτταροτοξικότητα. Με σκοπό την βελτίωση των χαρακτηριστικών του SPD-304 και την αποφυγή κυτταροτοξικότητας, σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν δομικά ανάλογά του τα οποία στοχεύουν την περιοχή του τριμερισμού του RANKL. Στα πλαίσια της παρούσας μεταπτυχιακής μελέτης αξιολογήθηκαν 9 ανάλογα του SPD-304 σε λειτουργικές δοκιμές RANKL-επαγόμενης οστεοκλαστογένεσης και κυτταροτοξικότητας. Τα αποτελέσματά μας έδειξαν ότι δύο από τα μόρια (PRA2.2.3, PRA2.2.2) δρουν παρόμοια με το SPD-304, δύο μόρια (PRA2.2.4, PRA9.2.8) είναι ελάχιστα λιγότερο τοξικά από το αρχικό μόριο ενώ μειώνεται λίγο και η δραστικότητά τους, δύο μόρια (PRA6.2.12, PRA6.3.12) είναι λιγότερο τοξικά και εξαιρετικά δραστικά σε σχέση με το SPD-304, ενώ σε τρία μόρια (PRA2.2.1, PRA5.2.8, PRA8.2.8) μειώθηκε δραματικά η κυτταροτοξικότητα επιδεικνύοντας πολύ καλά χαρακτηριστικά πρόσδεσης και αναστολής της δράσης του RANKL. Επίσης, για την ανίχνευση του τρόπου δράσης των αναλόγων του SPD-304, πραγματοποιήθηκαν πειράματα διασταυρούμενης σύνδεσης, τα οποία φανέρωσαν αύξηση των μονομερών της πρωτεΐνης παρουσία των αναστολέων, δηλαδή, ένα μηχανισμό δράσης παρόμοιο με το αρχικό μόριο. Από τα SPD-304 ανάλογα, το PRA8.2.8. επέδειξε τα καλύτερα χαρακτηριστικά και επιλέχθηκε για in vivo δοκιμή σε RANKL-επαγόμενα διαγονιδιακά μοντέλα οστεοπόρωσης που δημιουργήθηκαν πρόσφατα στο εργαστήριό μας.

Osteoporosis is a degenerative bone disease that affects a wide range of the elderly population worldwide, especially women after menopause. Patients suffering from osteoporosis exhibit reduction in bone mass, leading to fragile bones and increased incidence of fractures. Studies to identify the cause of the disease indicated that the metabolic pathway activated by RANKL protein and its receptor RANK plays a vital role in bone loss. RANKL regulates the function of specific cells in the organism, the osteoclasts that absorb bone during the normal process of bone remodeling. Increased levels of RANKL result in enhanced osteoclast activity leading to bone loss. The central role of RANKL in bone loss has been verified by the remarkable efficacy of a monoclonal antibody against human RANKL, denosumab, in postmenopausal osteoporosis. Denosumab inhibits RANKL binding to RANK and has been approved for the treatment of osteoporosis worldwide. In an attempt to discover new inhibitors of human RANKL, we focused on the small molecule SPD-304, that inhibits the trimerization of TNF. Our previous studies showed that it can also inhibit RANKL, but is very toxic. In order to improve the characteristics of SPD-304 and to decrease its toxicity, structural analogues of the SPD-304 molecule were designed and synthesized that target the trimerization region of RANKL. In this study, 9 analogues of SPD-304 have been evaluated in functional assays of RANKL-induced osteoclastogenesis and cell toxicity. The results showed that two molecules (PRA2.2.3, PRA2.2.2) had the same effect as SPD-304, two molecules (PRA2.2.4, PRA9.2.8) were subtly less toxic than the original, but also less active, two molecules (PRA6.2.12, PRA6.3.12) were less toxic and incredibly active compared to SPD-304, while in three molecules (PRA2.2.1, PRA5.2.8, PRA8.2.8) the toxicity was dramatically decreased, exhibiting great capacity for binding and inhibition of RANKL function. Furthermore, in order to detect how SPD-304 analogues operate, cross-linking experiments were conducted showing an increase in protein monomers, suggesting a similar mechanism of action with the original molecule. From these molecules, PRA8.2.8 showed the best characteristics and was chosen for in vivo evaluation in the RANKL-induced transgenic mouse models of osteoporosis developed in our lab recently.