Μελέτη πρόδρομων Ν,Ο-ετεροκυκλικών δομών ως αναστολείς της τρανσφεράσης γλουταθειόνης P1-1 ανθρώπου

Abstract

Οι τρανσφεράσες γλουταθειόνης (GSTs) είναι πολυλειτουργικά ένζυμα που συμμετέχουν στην κυτταρική αποτοξίνωση από ενδογενείς και εξωγενείς ηλεκτρονιόφιλες ενώσεις, μέσω κατάλυσης της δημιουργίας ομοιοπολικών συμπλόκων μεταξύ αυτών και της γλουταθειόνης (GSH). Απαντούν στα θηλαστικά, στα φυτά, στα έντομα, στους μύκητες και στα βακτήρια. Παρουσιάζουν πολλές δράσεις, μεταξύ των οποίων είναι η λειτουργία τους ως υπεροξειδάση, ισομεράση και διϋδροασκορβική ρεδουκτάση. Mέσω του ανωτέρω μηχανισμού αποτοξίνωσης, ορισμένα ισοένζυμα GST εμπλέκονται στο μηχανισμό ‘multiple drug resistance’ (MDR) καρκινικών κυττάρων, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα χημειοθεραπευτικών πρωτοκόλλων. Αυτό το πρόβλημα είχε ως αποτέλεσμα την ώθηση της έρευνας προς ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων και κοκτέιλς φαρμάκων με αυξημένη αποτελεσματικότητα. Στο πλαίσιο αυτό, οι τρανσφεράσες γλουταθειόνης αποτελούν μοριακό στόχο για τον σχεδιασμό νέων φαρμάκων και προ-φαρμάκων που θα δρουν στοχευμένα εκεί που υπερεκφράζονται τα συγκεκριμένα ισοένζυμα και εμφανίζουν υψηλή δραστικότητα, καθιστώντας έτσι το χημικοθεραπευτικό πρωτόκολλο περισσότερο αποτελεσματικό. Στην παρούσα μελέτη εξετάζονται δύο ομάδες συνθετικών ενώσεων οι οποίες δεν έχουν εξετασθεί έως τώρα ως πιθανοί αναστολείς GSTs. Oι εν λόγω ενώσεις έχουν αποδεδειγμένη χρησιμότητα στη φαρμακευτική επιστήμη. Οι δυο αυτές κατηγορίες ενώσεων είναι: (Α) οι ουρίες και τα κυκλοποιημένα παράγωγά τους, γνωστά ως βενζοδιαζεπίνες, και (Β) οι 2,2'-διυδροξυ-βενζοφαινόνες και τα Ν-καρβονυλικά παράγωγα τους. Η Ομάδα Α εξετάστηκε με τα ισοένζυμα hGSTΑ1, hGSTΤ2, hGSTO1, hGSTP1Α, hGSTP1B, hGSTP1C & SjGST, ενώ η Ομάδα Β εξετάστηκε με το ισοένζυμο hGSTP1Α και τα δύο αντίστοιχα αλλοένζυμα hGSTP1B & hGSTP1C. Σημειώνεται ότι, τα ισοένζυμα hGSTΑ1, hGSTP1Α, hGSTP1B & hGSTP1C έχουν μεγάλη σημασία για τον καρκίνο σε σχέση με το φαινόμενο MDR. Τα παρασκευάσματα των μελετηθέντων κλωνοποιημένων ενζύμων προέκυψαν κατόπιν ετερόλογης έκφρασης των αντίστοιχων πλασμιδίων σε E. coli BL21(DE3) και καθαρισμού των πρωτεϊνών που ενδιαφέρουν (2,4-91 φορές, 28-100% ανάκτηση) σε στήλες χρωματογραφίας συγγενείας, χρησιμοποιώντας είτε 1,4-βουτανοδιολο-διγλυκιδυλo-αιθέρα-GSH-Sepharose-CL6B (BES-GSH) για τα ένζυμα hGSTA1-1, hGSTP1A, hGSTP1B & hGSTP1C), είτε Ni-ιμινοδιοξικό οξύ-Sepharose (Ni-NTA-Sepharose) για τα ένζυμα hGSTΟ1-1 & hGSTT2-2. Αρχικά πραγματοποιήθηκε πειραματικός έλεγχος (‘σάρωση’) σε όλες τις ενώσεις εφαρμόζοντας φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό της δραστικότητας hGSTP1 χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα 1-χλωρo-2,4-δινιτροβενζόλιο (CDNB) και γλουταθειόνη (GSH), παρουσία και απουσία του υποψήφιου ‘αναστολέα’. Όσον αφορά στην Ομάδα Α, παρουσιάστηκε έλλειψη επαναληψιμότητας των αποτελεσμάτων, οπότε και διερευνήθηκε η δραστικότητα του ισοενζύμου hGSTA1-1 συναρτήσει του χρόνου παραμονής των διαλυμάτων τριών επιλεγμένων ενώσεων (δύο βενζοδιαζεπινών, 174 & 202, και μίας ουρίας, 195). Διαπιστώθηκε διακύμανση της ικανότητας αναστολής του ενζύμου από το ίδιο διάλυμα ενώσεως για περίπου μία εβδομάδα, γεγονός που δεν ενθάρρυνε την περαιτέρω μελέτη. Αναφορικά με την Ομάδα Β, τρεις ενώσεις έδωσαν σχετικά αξιόλογη αναστολή με τα αλλοένζυμα hGST1PA, B & C, για τις οποίες προσδιορίστηκαν οι τιμές IC50 και το είδος της αναστολής μέσω ενζυμικής κινητικής. Οι ενώσεις αυτές ήταν δύο Ν-ακυλο-υδραζόνες, ειδικότερα, η ένωση 14 έναντι του ενζύμου hGSTP1Α (61.7 %, 80.0 ± 4.9 μΜ) και η ένωση 16 έναντι του hGSTP1Β (40.7 %, IC50 = 115.0 ± 2.7 μΜ), και μία κετοξίμη, η ένωση 12 έναντι του hGSTP1C (50.7 %, IC50 = 101.5 ± 8.0 μΜ). Οι τρεις ανωτέρω ενώσεις φαίνεται να δεσμεύονται στην καταλυτική περιοχή του ενζύμου με τρόπο συναγωνιστικό ως προς το υπόστρωμα CDNB (Ki(14) = 63.6 ± 3.0 μM, Ki(16) = 198.6 ± 14.3 μM και Ki(12) = 16.5 ± 2.7 μM). Η ομάδα Β δεν παρουσίασε αξιόλογη αναστολή με την 6His- μορφή του ισοενζύμου hGSTP1A (η ένωση 13 έδωσε 11% αναστολή, η ένωση 14 25% αναστολή και η ένωση 15 11% αναστολή). Τα αποτελέσματα από την ενζυμική αναστολή και κινητική θα συνεκτιμηθούν με εκείνα που θα προκύψουν από in silico μοριακό μοντελισμό και ελλιμενισμό, προκειμένου να διαμορφωθεί μία ευκρινέστερη εικόνα για τον τρόπο δέσμευσης των υπό μελέτη αναστολέων στα ένζυμα-στόχο.

Glutathione transferases (GSTs) are multifunctional enzymes involved in cellular detoxification of endogenous and exogenous electrophilic compounds by catalyzing the formation of covalent complexes with glutathione (GSH). They are found in mammals, plants, insects, fungi and bacteria, exhibiting several functions, such as peroxidase, isomerase and dihydroascorbic acid reductase. Through the aforementioned detoxification mechanism, certain GST isoenzymes are involved in 'multiple drug resistance' (MDR) of tumor cells, compromising the effectiveness of chemotherapeutic protocols. This problem resulted in a thrust of research towards developing anticancer drugs and drug ‘cocktails’ of increased efficiency. In this context, glutathione transferases are molecular targets for the design of new drugs and pro-drugs targeting specifically sites overexpressing GST isoenzymes exhibiting high activity, thus making more effective chemotherapeutic protocols. In the present study we examined two groups of synthetic compounds ('libraries') which, to the best of our knowledge, have not been studied before as potential inhibitors of GSTs, although they have shown considerable usefulness in pharmaceutical science: Group A, featuring ureas and their cyclic derivatives, known also as benzodiazepines, and Group B, featuring 2,2'-dihydroxy-benzophenones and their N-carbonyl derivatives. Group A was examined with isoenzymes hGSTA1, hGSTT2, hGSTO1, hGSTP1A, hGSTP1B, hGSTP1C & SjGST while Group B was examined with isoenzyme hGSTP1A and the two respective alloenzymes hGSTP1B & hGSTP1C. Notably, isoenzymes hGSTA1, hGSTP1A, hGSTP1B & hGSTP1C are important for cancer research in relation to MDR. The preparations of the studied cloned enzymes were derived after expression of the respective plasmids in E. coli BL21(DE3) and purification of the proteins of interest (2.4-91 fold, 28-100% recovery) on affinity columns, either 1,4-butanediol-diglycidyl ether-GSH-Sepharose-CL6B (BES-GSH) for enzymes hGSTA1-1, hGSTP1A, hGSTP1B & hGSTP1C, or Ni-iminodiacetic acid-Sepharose (Ni-NTA-Sepharose) for enzymes hGSTΟ1-1 & hGSTT2-2. Initially we performed screening experiments with all compounds, by applying spectrophotometric assays of hGSTP1 using as substrates 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) and glutathione (GSH), in the presence and absence of candidate inhibitors. Regarding Group A, we followed the enzyme activity of hGSTA1-1 versus the elapsed time of the solutions of the three selected compounds (two benzodiazepines, 174 & 202, and one urea, 195). We obtained inconsistent results on enzyme activity in the presence of each of the three compounds for up to one week, thus discouraging any further study. Regarding Group B, three compounds gave relatively good inhibition with allozymes hGST1PA, B & C, thus were put in the test for IC50 determination and enzyme kinetics to reveal their inhibition modality. The selected inhibitors were two N-acyl-hydrazones, compound 14 against the isoenzyme hGSTP1A (61.7 %, IC50 = 80.0 ± 4.9 μM) and compound 16 against the isoenzyme hGSTP1B (40.7%, IC50 = 115.0 ± 2.7 μM), and a ketoxime, compound 12 against the isoenzyme hGSTP1C (50.7%, IC50 = 101.5 ± 8.0 μM). All three inhibitors appeared to bind at catalytic region of the targeted enzyme in a competitive manner with respect to the substrate CDNB (Ki(14) = 63.6 ± 3.0 μΜ, Ki(16) = 198.6 ± 14.3 μΜ and Ki(12) = 16.5 ± 2.7 μΜ). Group Β failed to give notable inhibition with the 6His-form of the isoenzyme hGSTP1A (compound 13 gave 11% inhibition, compound 14 25% inhibition and compound 15 11% inhibition). The results from enzyme inhibition and kinetics studies were considered together with those obtained from in silico molecular modeling and docking, in order to comprehend better the mode of interaction of the studied compounds with the targeted enzymes.