Οι τρανσφεράσες γλουταθειόνης (GSTs) αποτελούν μια μεγάλη οικογένεια ενζύμων με βασική λειτουργία την αποτοξίνωση του οργανισμού μέσω της τροποποίησης τοξικών ενδογενών ή εξωγενών ενώσεων (ηλεκτρονιόφιλων ενώσεων) με τη δημιουργία ομοιοπολικού συμπλόκου μεταξύ αυτών και της γλουταθειόνης (GSH). Ειδικότερα, το ισοένζυμο τρανσφεράση γλουταθειόνης Α1-1 ανθρώπου (hGSTA1-1) έχει βρεθεί να υπερεκφράζεται σε καρκινικά κύτταρα, μειώνοντας την αποτελεσματικότητα των χημειοθεραπευτικών φαρμάκων. Για τον λόγο αυτόν, είναι αναγκαία η ανάπτυξη αντικαρκινικών φαρμάκων και κοκτέιλς φαρμάκων με αυξημένη αποτελεσματικότητα. Επομένως, το ισοένζυμοhGSTA1-1 αποτελεί μοριακό στόχο για τον σχεδιασμό νέων φαρμάκων και προφαρμάκων, τα οποία θα δρουν στοχευμένα στις θέσεις που υπερεκφράζεται το ένζυμο.
Στην παρούσα εργασία εξετάστηκε μία ομάδα 2,2'-διυδροξυ-βενζοφαινονών και Ν-καρβονυλικών παραγώγων τους που δεν έχουν μελετηθεί μέχρι σήμερα ως πιθανοί αναστολείς του ενζύμου hGSTA1-1.
Αρχικά, εφαρμόζοντας φασματοφωτομετρικό προσδιορισμό ενζυμικής δραστικότητας, πραγματοποιήθηκε σάρωση των υποψήφιων αναστολέων (screening) έναντι της επίδρασής τους στη δραστικότητα του ισοενζύμου hGSTA1-1, χρησιμοποιώντας ως υποστρώματα το 1-χλωρo-2,4-δινιτροβενζόλιο (CDNB) και τη γλουταθειόνη (GSH), παρουσία και απουσία ‘αναστολέα’. Σύμφωνα με τα αποτελέσματα της σάρωσης, οι ενώσεις 6, 8, 14 και 16 επέφεραν αναστολή πάνω από 80 % και για αυτό μελετήθηκαν περαιτέρω. Ειδικότερα, υπολογίστηκε ο δείκτης IC50 (half maximal inhibitory concentration) για τις επιλεγείσες ενώσεις, IC50(6) = 1,75 ± 0,11 μΜ, IC50(8) = 0,24 ± 0,04 μΜ, IC50(14) = 0,33 ± 0,06 μΜ και IC50(16) = 0,18 ± 0,01 μΜ. Επιπλέον, πραγματοποιήθηκε κινητική μελέτη της ενζυμικής αναστολής για τις επιλεγείσες ενώσεις, προκειμένου να διευκρινιστεί ο τύπος της αναστολής. Οι ενώσεις 6 και 14 έδειξαν καθαρά συναγωνιστική αναστολή, χρησιμοποιώντας το CDNB ως υπόστρωμα μεταβαλλόμενης συγκέντρωσης, με σταθερές αναστολής Ki(6) = 1,47 ± 0,15 μΜ και Ki(14) = 0,38 ± 0,05 μΜ αντίστοιχα, ενώ οι εν λόγω ενώσεις παρουσίασαν μικτού τύπου αναστολή ως προς την GSH. Όσον αφορά στις ενώσεις 8 και 16, οι οποίες φέρουν ένα άτομο βρωμίου, τόσο με το CDNB (Ki(8) = 0,36±0,11 μΜ και Ki(16) = 1,75±0,25 μΜ) όσο και με τη GSH, ως μεταβαλλόμενο υπόστρωμα, αντιστοίχως, έδειξαν μικτού τύπου αναστολή.
Τα αποτελέσματα από την κινητική μελέτη συνεκτιμήθηκαν με τα αποτελέσματα που προέκυψαν από in silico μοριακό μοντελισμό και ελλιμενισμό (docking), προκειμένου να έχουμε μία πληρέστερη εικόνα του τρόπου αλληλεπίδρασης και αναστολής των υπό μελέτη αναστολέων έναντι του ενζύμου.
Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας, συντέθηκαν χημικά και αναλύθηκαν φασματοσκοπικά οι ενώσεις 6 και 8, προκειμένου να υπάρξουν οι απαιτούμενες ποσότητες για να μελετηθούν ως ανωτέρω.
Glutathione transferases comprise a big family of enzymes with basic function the detoxification of organism via the inactivation of endogenous or exogenous toxic compounds (electrophilic compounds) by creating a covalent complex between them and glutathione (GSH). Specifically, the human isoenzyme transferase glutathione A1-1 (hGSTA1-1) is found to be overexpressed in cancer cells, reducing the effectiveness of chemotherapeutic drugs. For this reason, the development of anticancer drugs and drug cocktails with increased efficiency is necessary. Thus, the isoenzyme hGSTA1-1 constitutes a molecular target for the design of new drugs and prodrugs which would target selectively positions overexpressing the enzyme of interest.
This study examines a library of 2,2'-dihydroxy-benzophenones and N-carbonyl derivatives which have not been examined so far as potential inhibitors of hGSTA1-1.
Primarily, by applying spectrophotometric determinations of enzyme activity, we screened the library for potential inhibitors towards the activity isoenzyme hGSTA1-1, using the 1-chloro-2,4-dinitrobenzene (CDNB) and glutathione (GSH) as substrates, in the presence and the absence of compound. On the basis of the results obtained, compounds 6, 8, 14 and 16 showed high inhibition (over 80 %) so they were taken to further study. Specifically, the index IC50 (half maximal inhibitory concentration) of the chosen compounds was and found: IC50(6) = 1,75 ± 0,11 μΜ, IC50(8) = 0,24 ± 0,04 μΜ, IC50(14) = 0,33 ± 0,06 μΜ and IC50(16) = 0,18 ± 0,01 μΜ. Furthermore, of enzyme inhibition kinetic studies were undertaken for the chosen compounds, in order to elucidate the inhibition modality. Compounds 6 and 14 displayed purely competitive inhibition, using CDNB as variable substrate, with inhibition constant Ki(6) = 1,47 ± 0,15 μΜ and Ki(14) = 0,38 ± 0,05 μΜ respectively, while both showed mixed type of inhibition with GSH as variable substrate. Compounds 8 and 16, bearing a bromine atom, either with CDNB (Ki(8) = 0,36 ± 0,11 μΜ and Ki(16) = 1,75 ± 0,25 μΜ) or GSH as variable substrates respectively, they showed a mixed type of inhibition.
The results of the enzyme kinetics were evaluated along with those obtained by in silico molecular modeling and docking, so as to better understand the binding and inhibition modality of the studied compounds towards the target hGSTA1-1.
Within the framework of the present study, compounds 6 and 8 were chemically synthesized and analyzed spectroscopically, in order to ensure the quantities required.
