Μοριακές και in vitro καλλιέργειας προσεγγίσεις στο φυτό Salvia

Abstract

Το αρωματικό φυτό Salvia sclarea αποτελεί έναν από τους πιο δημοφιλής εκπροσώπους της οικογένειας των Lamiaceae, καθώς το αιθέριο έλαιο του φυτού αξιοποιείται ευρέως στην κοσμετολογία, στη βιομηχανία τροφίμων και στην φαρμακοβιομηχανία. Τα άνθη και τα φύλλα του φυτού αποτελούν την μεγαλύτερη πηγή του διτερπενίου σκλαρεόλη, χημική ουσία εξέχουσας σημασίας για το τομέα της αρωματοποιίας, η έκκριση της οποίας, όπως και των δύο ακόμη βασικών συστατικών του ελαίου, των μονοτερπενίων λιναλοόλη και οξικό εστέρα της λιναλοόλης πραγματοποιείται από αδενώδη τριχώματα με δομή οστού («capitate glandular hairs»), ενώ από ασπιδοειδή αδενώδη τριχώματα («peltate glandular hairs) εκκρίνεται το σεσκιτερπένιο γερμακρένιο D. Παράλληλα, λόγω της υψηλής εμπορικής και οικονομικής σημασίας που προσδίδουν οι δευτερογενείς μεταβολίτες του, το φυτό Salvia sclarea αποτελεί είδος αυξημένου ενδιαφέροντος και για το τομέα της ιστοκαλλιέργειας. Σκοπός της παρούσας εργασίας είναι η συγκριτική μελέτη των επιπέδων έκφρασης γονιδίων που εμπλέκονται σε μονοπάτια του δευτερογενούς μεταβολισμού στο φύλλο, στα τριχώματα, στο φύλλο απουσία τριχωμάτων και σε κάλλο, του φυτού, μέσω των διαδικασιών της απομόνωσης ολικού RNA και της ηπιποσοτικής RT-PCR. Ταυτόχρονα, μέσω κατάλληλων τεχνικών ιστοκαλλιέργειας, στόχος είναι η δημιουργία κάλλου και τελικά η λήψη αναγεννημένων φυτών.

Στην εν λόγω μελέτη δύο τροποποιημένα πρωτόκολλα κρίθηκαν καταλληλότερα για την απομόνωση ολικού RNA από τους ιστούς του φυτού, καθώς εφαρμογή του διαδεδομένου σε χρήση πρωτόκολλου phenol/chloroform extraction οδήγησε στην απόκτηση δειγμάτων χαμηλής καθαρότητας, ως προς τις προσμίξεις με πρωτεΐνες και φαινολικά. Ωστόσο, στα πλαίσια της εργασίας αυτής δεν κατέστη εφικτή η επιτυχημένη ενίσχυση των επιθυμητών γονιδίων, τόσο στο φύλλο όσο και στη τρίχα, πιθανόν λόγω μειωμένης ειδικότητας πρόσδεσης κάθε ζευγαριού εκκινητών στη μήτρα, απόρροια των περιορισμένων, μέχρι σήμερα, βιβλιογραφικών δεδομένων για Salvia sclarea. Το ενδεχόμενο αυτό ενισχύεται σημαντικά, τόσο από την εν γένει υψηλή ομολογία μεταξύ συνθετασών μόνο-, δί-, και σέσκι- τερπενίων, όσο και σε επίπεδο υπο-οικογένειας. Όσον αφορά την καλλογένεση, τέσσερα από τα έξι θρεπτικά υποστρώματα που χρησιμοποιήθηκαν οδήγησαν στην εμφάνιση κάλλου, με δύο από αυτά να αποδεικνύονται καταλληλότερα από άποψη μορφολογίας, δυναμικού ανάπτυξης και χρόνου καλλογένεσης. Τέλος, η επαγωγή της βλαστογένεσης αποδείχθηκε ανεπιτυχής, ενώ σε ορισμένα θρεπτικά υποστρώματα σημειώθηκε εμφάνιση κάλλου ή αύξηση του μεγέθους του ήδη υπάρχοντος.

Salvia sclarea (clary sage) is one of the most popular aromatic plants of the Lamiaceae family, due to the fact that the plant’s essent ial oil is widely used in cosmetology, in the food industry, and also in the pharmaceutical industry. Plant’s leaves and inflorescence are the biggest source of sclareol in nature, a diterpene of great importance for the fragrance industry. Sclareol, as well as linalool and linalyl acetate, the other two dominant ingredients in Salvia sclarea oil are secreted by capitate glandular hairs, while the sesquiterpene germacrene D is secreted by peltate glandular hairs. In the same time, the increased commercial and economic value of Salvia sclarea because of its secondary metabolites, led to its use also in tissue culture techniques. The aim of this essay was to study the expression levels of genes participating in different pathways of secondary metabolism, in whole leaves, isolated trichomes, leaves without trichomes and callus from Salvia sclarea, by carrying out the procedures of total RNA isolation and semiquantitative RT-PCR analysis. Moreover, the goal was the achievement of callus induction and the production of regenerated plants through in vitro techniques.

As a result of this study, two modified protocols were found to be the most suitable for the isolation of high quality total RNA from Salvia sclarea tissues, compared to the widely used phenol/chloroform extraction protocol, which resulted in samples containing high levels of polyphenols and proteins. However, the amplification of selected genes was not achieved during this essay, probably due to primers’ low specificity with the target, due to limited bibliographic data concerning Salvia sclarea. The existing high homology not only between monoterpene, diterpene and sesquiterpene synthases, but also within each subfamily enhances the probability of mispriming mentioned before. As far as callogenesis is concerned, four out of six different types of medium resulted in callus induction, while two of them were found to be more suitable when callus morphology, growth capacity and days to visible callus are taken into account. Finally, shoot induction was not achieved, while in some cases callus induction or gain in the pre-existing callus size was observed.